LncRNA MRPL39通過海綿吸附miR-130靶向PTEN調控人肺癌細胞的遷移和侵襲

范慶浩,鮑獻榮,趙 涵

(金華市人民醫院 心胸外科,浙江 金華 321000)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要類型,目前尚缺乏持續有效的治療方案,從分子生物學層面挖掘新型治療靶標,將有重要的臨床意義[1]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)對腫瘤的發生發展有重要的調控作用[2-3]。研究[4]表明,LncRNA MRPL39可靶向miR-130抑制胃癌細胞的增殖。前期通過檢索GEO數據庫中NSCLC肺癌組織與正常肺組織的miRNA測序芯片數據(ID:200135918),發現miR-130在NSCLC中表達下降。Ye等[5]研究也顯示,低表達miR-130與NSCLC患者不良預后密切相關。但miR-130在NSCLC中的上游調控機制尚未闡明。故本研究檢測MRPL39和miR-130在NSCLC組織標本中的表達水平,并在細胞水平和動物水平驗證MRPL39對miR-130及NSCLC的影響,擬探究MRPL39在NSCLC中是否可能靶向miR-130促進疾病的發生發展。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2021年6月—2021年12月于我院心胸外科首次確診、需手術切除的NSCLC患者30例,術中留取癌組織和癌旁組織;患者術前未接受過其他抗腫瘤治療。其中男13例,女17例;年齡41～72歲,平均(56.37±12.41)歲;病理類型:鱗癌18例,腺癌10例,其他2例;NSCLC分級:Ⅰ級3例,Ⅱ級8例,Ⅲ級13例,Ⅳ級6例。受試患者均知情同意,本研究經醫院倫理委員會審批。

1.2 細胞與動物來源 人肺腺癌細胞系A549購自美國ATCC細胞中心;20只BALB/c裸鼠購自南京大學模式動物研究所,4～5周齡,體質量18～22 g,動物許可證號:SCXK(蘇)2021-0010,于特定無病原體條件下飼養。

1.3 細胞培養與轉染 以DMEM培養基(含10%胎牛血清)、37 ℃、5%CO2條件培養細胞,隔天更換培養基,待細胞生長至80%時進行傳代培養,取對數生長期細胞分為空白組、sh-NC組、sh-MRPL39組、sh-MRPL39+anti-miR-NC組和sh-MRPL39+anti-miR-130組,根據脂質體2000(美國Invitrogen公司)說明書進行轉染,空白組不做轉染處理,sh-NC組、sh-MRPL39組、sh-MRPL39+anti-miR-NC組和sh-MRPL39+anti-miR-130組分別將雜序shRNA、sh-MRPL39、sh-MRPL39+無意義小分子陰性對照片段和sh-MRPL39+miR-130抑制劑(由上海吉凱公司合成)轉入細胞,轉染48 h后收集細胞用于后續實驗。

1.4 qPCR法檢測組織及細胞中MRPL39和miR-130表達 采用Trizol法提取組織及細胞中總RNA,測定A260/A280值,取合格樣本進行cDNA合成和PCR擴增,逆轉錄試劑盒和SYBR Green qPCR Master Mix購自日本TaKaRa公司,PCR擴增條件:94 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,共38個循環。以U6為內參,2-ΔΔCt法半定量計算MRPL39和miR-130表達。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 收集轉染細胞調整密度為1×104個/mL接種96孔板,正常培養24 h后加入CCK-8試劑(上海碧云天公司)20 μL /孔,避光培養4 h,于450 nm處檢測各孔吸光度值(A),計算細胞存活率(A樣本孔/A空白孔×100%)。

1.6 Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲 收集轉染細胞調整密度為2×105個/mL接種小室上室,其中侵襲實驗中小室上室用基質膠包被,遷移實驗不作此操作;下室添加含有20%胎牛血清培養基建立遷移/侵襲模型,培養48 h,拭去上室內殘留細胞和或基質膠,固定后用0.1%結晶紫染色,光鏡下計數遷移細胞數和侵襲細胞數(5個隨機視野)。

1.7 雙熒光素酶報告基因驗證MRPL39與miR-130靶向關系 通過在線生物學軟件starBase預測MRPL39與miR-130的潛在結合位點信息,委托上海吉凱公司合成野生型MRPL39載體(WT-MRPL39)和突變型MRPL39載體(MUT-MRPL39),分別將上述載體、mimic-NC、miR-130 mimic轉染細胞,最后收集細胞檢測熒光素酶活性。

1.8 蛋白印跡法檢測細胞和組織中上皮間質轉化(EMT)標志物和第10號染色體丟失的磷酸酶基因(PTEN)表達 添加細胞裂解液提取組織和細胞中總蛋白,水浴變性后,各組取50 μg蛋白進行電泳,設置90 V、50 min跑濃縮膠,110 V、30 min跑分離膠,轉膜后加入5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h,再分別加入E鈣黏素(E-cadherin)、N鈣黏素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、PTEN和β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology公司),稀釋比為1∶1 000,4 ℃孵育過夜,再加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記蛋白二抗(上海碧云天公司)37 ℃下孵育1 h,最后添加化學發光劑發光顯影。利用Image J軟件測定條帶灰度值,以β-actin標準化計算目的蛋白的相對蛋白表達量。

1.9 構建裸鼠成瘤模型 將20只BALB/c裸鼠隨機分為sh-NC組和sh-MRPL39組,分別取穩定轉染細胞于裸鼠后腿皮下種植,每天觀察裸鼠及腫瘤生長情況,待肉眼可見瘤體后,30 d時終止觀察,斷頭處死裸鼠,分離瘤體,測量其長、短徑及體質量,計算體積(短徑2×長徑/2)。

2 結果

2.1 MRPL39和miR-130在組織樣本及細胞中的表達 與癌旁組織比較,肺癌組織中MRPL39水平升高,miR-130水平降低;差異均有統計學意義(P<0.05),見表1。sh-MRPL39組細胞中MRPL39水平(0.34±0.09)低于空白組(1.00±0.14)和sh-NC組(1.06±0.18),差異有統計學意義(F=39.834,P<0.001);空白組和sh-NC組間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 MRPL39和miR-130在肺癌組織及癌旁組織中的表達水平

2.2 低表達MRPL39對細胞增殖、遷移及侵襲的影響 與sh-NC組比較,sh-MRPL39組細胞的存活率降低,遷移細胞數和侵襲細胞數減少,差異均有統計學意義(P<0.05);但空白組和sh-NC組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 低表達MRPL39對細胞增殖、遷移及侵襲的影響

2.3 低表達MRPL39對細胞中EMT標志物表達的影響 與sh-NC組和空白組比較,sh-MRPL39組細胞中E-cadherin表達升高,N-cadherin和Vimentin表達降低,差異均有統計學意義(F=29.084、7.270、22.520,均P<0.01);但空白組和sh-NC組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 細胞中EMT標志物的表達

2.4 低表達MRPL39對裸鼠移植瘤的影響 與sh-NC組比較,sh-MRPL39組移植瘤中MRPL39的表達、體積和體質量均明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 低表達MRPL39對裸鼠移植瘤MRPL39表達、體積和重量的影響

2.5 MRPL39與miR-130的靶向關系 如圖2顯示,MRPL39與miR-130存在互補序列;與其他3組比較,miR-130 mimic+WT-MRPL39組細胞熒光素酶相對活性(0.52±0.11)降低,差異有統計學意義(F=12.757,P<0.001)。sh-MRPL39組、sh-MRPL39+anti-miR-NC組細胞中miR-130的表達水平(1.63±0.18、1.58±0.15)均高于sh-NC組(1.00±0.14)和sh-MRPL39+anti-miR-130組(1.24±0.21),差異均有統計學意義(F=14.911,P<0.001)。

圖2 MRPL39與miR-130的靶向結合位點

2.6 MRPL39靶向miR-130對細胞增殖、遷移和侵襲的影響 如表4所示,sh-MRPL39組和sh-MRPL39+anti-miR-NC組的細胞存活率、遷移細胞數、侵襲細胞數,差異均無統計學意義(P>0.05);而sh-MRPL39+anti-miR-130組均高于sh-MRPL39+anti-miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 MRPL39靶向miR-130對細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.7 MRPL39靶向miR-130對細胞中EMT標志物和PTEN表達的影響 如表5所示:與sh-MRPL39+anti-miR-NC組比較, sh-MRPL39組的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PTEN的表達水平差異均無統計學意義(P>0.05);sh-MRPL39+anti-miR-130組E-cadherin表達降低,N-cadherin、Vimentin和PTEN表達升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。

表5 MRPL39靶向miR-130對細胞中EMT標志物和PTEN表達的影響

3 討論

手術切除是NSCLC的主要治療手段,對于無法行手術治療者,放化療等治療雖可局部緩解病情,但整體效果不佳[6]。LncRNAs可參與多種生物學功能,如染色體重構、干細胞重編程、免疫調節等,在多種癌癥中存在失調表達[7-8]。MRPL39定位于人21號染色體,大小為1 725 bp,最早被Li等[9]發現存在于胃癌組織中,其表達較癌旁正常胃組織低。進一步機制研究發現,MRPL39在胃癌細胞中可直接作用于miR-130,可能是一種新型胃癌生物學標志物[5]。但MRPL39的生物學效應尚未完全顯現,其是否參與了NSCLC的生物學過程仍不清楚。

本研究結果顯示,相較于癌旁組織,NSCLC患者肺癌組織樣本中MRPL39表達明顯上調,提示MRPL39在NSCLC中可能發揮促癌作用。進一步研究以明確MRPL39對肺癌細胞功能的影響,發現敲低MRPL39可抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力。EMT是促進腫瘤細胞癌變的重要病理機制,在此過程中,上皮細胞轉化為具有間質表型的細胞,導致惡性腫瘤細胞出現惡性生物學行為[10]。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin均是EMT中的標志蛋白,其中E-cadherin可參與細胞間黏附,維持細胞間連接,阻止細胞活動侵襲與轉移擴散;N-cadherin和Vimentin是間質細胞標志物,其表達增加表明細胞呈現EMT,遷移與侵襲能力增強[11]。本研究中,敲低MRPL39表達后,細胞中E-cadherin表達增加,N-cadherin和Vimentin表達降低,進一步表明敲低MRPL39可抑制細胞EMT,實現對NSCLC的抑制作用。同時,裸鼠成瘤模型結果也表明,敲低MRPL39可抑制瘤體生長。

本研究利用雙熒光素酶報告基因實驗驗證,MRPL39與miR-130存在靶向關系,敲低MRPL39表達可促進細胞中miR-130表達。miR-130在肝癌[12]、乳腺癌[13]等多種癌癥中存在異常表達,并與腫瘤細胞的增殖和凋亡有關。本研究發現,miR-130在NSCLC組織中表達異常降低,干擾miR-130表達可部分逆轉沉默MRPL39對細胞增殖、遷移和侵襲的影響,及上皮間質轉化轉移和PTEN表達的抑制作用。研究[9]表明,miR-130與PTEN在NSCLC中存在靶向調控作用,miR-130可解除PTEN對肺癌細胞生長的刺激作用。提示MRPL39可能通過海綿吸附miR-130靶向調控PTEN,影響A549細胞增殖、遷移與侵襲過程。

綜上所述,LncRNA MRPL39在NSCLC組織中高表達,LncRNA MRPL39/miR-130/PTEN軸可能參與調控A549細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究有望為LncRNA的靶向治療提供新靶點,抑制MRPL39表達可能對NSCLC有治療效果,但未來還需要更多的研究數據作支撐。