代謝組學在失眠癥及其中醫藥干預研究中的應用進展

胡 金 韋姍姍 邱祥玉 方留斌 陽 吉 楊夢霞 湯滴微

(1 云南中醫藥大學基礎醫學院,昆明,650500; 2 云南中醫藥大學第二臨床醫學院,昆明,650500)

失眠作為現代社會普遍存在的健康問題,嚴重影響人們的生命質量和身心健康,甚至會加重或引發其他疾病。長期失眠是肥胖、糖尿病、高血壓、心臟病和中風的危險因素,從長遠來看,可能會導致過早死亡[1]。大量流行病學研究顯示,失眠在人群中已相當普遍,其發病率達35%～50%[2]。失眠已被證明是生物、心理和社會因素相互作用的結果,但其影響睡眠時間和睡眠質量的病理作用機制目前尚未被闡明[3-4]。多導睡眠圖是診斷原發性失眠的金標準,但其價格昂貴且耗時,在臨床實施過程中存在一定困難[5]。因此,目前失眠的診斷仍依靠患者的自我報告,缺乏準確、快速、客觀的失眠診斷標志物。

代謝組學是一種通過評估現有條件所帶來的“凈”生物效應(無論是健康、疾病還是干預)來認知整體的生理或病理狀態的綜合方法[6]。能夠直接反映在特定時刻發生的代謝途徑的活動,并可以放大在基因組水平上控制的微小變化,在生物標志物發現、藥物作用機制、發病機制的補充、中醫辨證等方面發揮著不可替代的作用。近年來,研究者運用代謝組學方法發現原發性失眠與氨基酸代謝通路、神經遞質代謝通路、能量代謝、脂質代謝通路密切相關。并基于代謝組學探究相關催眠藥物(包括中藥、中藥單體、化學藥物)對相關代謝標志物的調控作用。本文總結了代謝組學在失眠方面的研究進展,以求對失眠的生物標志物和代謝途徑有更深刻的認識,為診斷、預防、治療失眠提供新的思路。

1 代謝組學技術及其運用

代謝組學被定義為定量測量生命系統對病理生理刺激或基因修飾的時間相關多參數的一門學科[7]。其基于高效液相色譜、氣相色譜-質譜聯用、液相色譜-質譜聯用、磁共振成像等技術平臺,以血液、尿液、腦脊液、組織、糞便、細胞等為檢測樣本,以獲得差異性代謝物,并基于差異性代謝物進行快速和全面的分析來闡明生理或病理途徑[8]。此外,代謝組學具有降低檢測限制和持續監測的優勢,其無創性、敏感性和持久性等特性在診斷標志物發現、疾病預后、藥物作用機制、藥效評價、中醫辨證方面發揮著自己獨特的作用[9]。

2 失眠與相關代謝途徑

2.1 失眠與氨基酸、神經遞質代謝 睡眠調節包括3個基本過程:一是調節清醒時睡眠傾向上升和睡眠時睡眠傾向消散的穩態過程;二是調節晝夜節律過程,基本上獨立于先前的睡眠和覺醒狀態,并決定睡眠傾向高低的周期交替;三是在睡眠中發生的經典過程,表現為非快速眼動睡眠(Non-Rapid Eye Movement Sleep,NREM)和快速眼動睡眠(Rapid Eye Movement Sleep,REM)2種基本睡眠狀態的交替過程[10]。其調節是復雜的,涉及不同的大腦回路和神經遞質。一方面,睡眠和覺醒控制是由喚醒促進神經元和促進睡眠的神經元相互協調并創建一個系統的“開關”,以此來調控睡眠覺醒行為。其中覺醒由喚醒促進神經元控制,包括藍斑的去甲腎上腺素能神經元、中縫核的5-羥色胺能神經元、結節乳頭核的組胺能神經元和下丘腦外側區的食欲素神經元。促睡眠神經元包括間腦的褪黑素神經元和視前腹外側核/中間核、視前正中核和腦干面旁區的γ-氨基丁酸能神經元[11]。另一方面,清醒和睡眠狀態之間的復雜調節過程需要由腦實質中不同的神經化學變化協調。如參與喚醒的分子,食欲素、血清素、去甲腎上腺素、組胺、多巴胺、腎上腺素;用于NREM的γ-氨基丁酸、腺苷、前列腺素和用于REM的乙酰膽堿和谷氨酸等分子負責每個階段的表達和維持[12]。

氨基酸及其代謝產物在神經系統健康和功能中發揮著重要作用,它們不僅是蛋白質的組成部分,也是大部分神經遞質合成的前體。研究表明,作為自身神經遞質的氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸)通常很難通過血腦屏障,而一些作為大腦中各自神經遞質前體的氨基酸如色氨酸、酪氨酸、精氨酸、蘇氨酸、甘氨酸等則更容易穿過。因此,這些神經遞質的合成可能會受飲食提供的這些前體分子的可用性的影響[13]。

其中,色氨酸是神經遞質5-羥色胺的前體,經色氨酸羥化酶催化首先生成5-羥色氨酸,再經5-羥色氨酸脫羧酶催化成5-羥色胺。色氨酸是一種可減少睡眠潛伏期的氨基酸[14]。一般來說,大腦中的色氨酸是不飽和的,因此服用色氨酸會導致5-羥色胺合成增加[15]。此外,色氨酸也是合成褪黑素的前體,色氨酸在色氨酸羥化酶的作用下合成5-羥色胺,在脫羧酶的作用下進一步形成血清素,在5-羥色胺-N-乙酰轉移酶和N-乙酰血清素O-甲基轉移酶的催化作用合成褪黑素[16]。褪黑素已被證明可以同步晝夜節律,并改善睡眠的開始、持續時間和質量[17]。

酪氨酸是兒茶酚胺類神經遞質多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素合成的前體物質,其首先在酪氨酸羥化酶的作用下形成二羥基苯丙氨酸,在脫羧的作用下進一步形成多巴胺,在多巴胺羥化酶的作用下形成去甲腎上腺素,進一步在苯乙胺-N-甲基轉移酶酶的作用下合成腎上腺素[18]。多巴胺的細胞外水平在清醒期間較高,而在NREM期間較低,這表明多巴胺神經元具有清醒活性[19]。去甲腎上腺素由幾個腦干核團產生,在激活交感神經系統的情況下有助于產生喚醒。藍斑是前腦去甲腎上腺素的主要來源,其在清醒時放電最快,在NREM期間活動較少,而在REM期間幾乎沉默[20]。夜間睡眠期間的腎上腺素濃度顯著低于清醒期間,而REM期間的腎上腺素濃度顯著低于NREM,在早晨清醒后腎上腺素濃度逐漸開始升高,表明交感神經系統腎上腺素的分泌在睡眠覺醒中起到關鍵作用[21]。研究發現,容易出現睡眠問題的人具有過度活躍的交感神經系統[22]。

支鏈氨基酸(包括亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)被積極用作氨基酸供體以在大腦中合成谷氨酸[23]。而三羧酸循環的中間產物α-酮戊二酸是形成谷氨酸的前體物質,其在乙酰輔酶A的作用下進入三羧酸循環通過轉胺反應生成谷氨酸,谷氨酸在γ-氨基丁酸旁路代謝過程中在谷氨酸脫羧酶催化作用下谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸[24]。γ-氨基丁酸能神經元和神經遞質調節杏仁核中的大腦回路,以調節REM和NREM,尤其是慢波睡眠睡眠和調節視交叉上核晝夜節律[25-26]。

組氨酸是組胺的前體,經脫羧后可形成組胺[27]。由于其能夠穿過血腦屏障,故血液中的組氨酸水平可能反映了結節乳頭核的腦組胺水平和組胺能神經元活動,它們在維持覺醒中起著關鍵作用[28]。結節乳頭核放電率和組胺釋放在清醒時最高,在NREM睡眠時較低,在REM睡眠時最低[29-30]。服用組胺或組胺受體激動劑可增加皮層激活和覺醒,同時減少NREM和REM睡眠[31-32]。相反,減少組胺信號轉導的藥物,包括經典抗組胺藥,如H1受體拮抗劑苯海拉明、吡拉明和低劑量多塞平會增加NREM和REM睡眠[33]。膽堿和乙酰輔酶A相互作用生成乙酰膽堿[34],其在REM的觸發和長期調節中都起著重要作用[35]。神經遞質合成的前體物質及其作用見圖1。

圖1 睡眠與氨基酸、神經遞質代謝關系

2.2 失眠與糖、神經遞質代謝 大腦具有獨特的代謝特征,只能通過三羧酸循環和氧化磷酸化分解有氧葡萄糖來獲得所需的能量[36]。糖酵解可以忽略不計,僅在長時間禁食時觀察到來自脂肪酸的酮體的使用。神經元的活動水平與大腦中的能量消耗密切相關,隨著神經元活動的增加,能量消耗也隨之增加[37]。從能量的角度來看,睡眠主要功能之一是恢復由清醒的能量需求引起的大腦能量代謝[38]。在睡眠期間,ATP生成增加,使能量儲備增加,從而減少炎癥,促進細胞存活。而在睡眠剝奪期間,ATP的生成顯著減少。大腦不再能夠啟動修復,導致神經細胞死亡。細胞死亡最終會導致情感障礙、記憶和學習障礙以及認知功能障礙[39]。這與突觸穩態理論一致,大腦每天需要與環境斷開一段時間,以恢復清醒時消耗的能量,在不斷學習生活經驗的過程中建立新的突觸并加強突觸網絡[40]。

腺苷是“能量貨幣”ATP水解的最終產物。腺苷和睡眠的增加與完整的膽堿能系統有關,腺苷代謝和通過三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷的轉運使腺苷與細胞的能量代謝直接相關[37]。在中樞神經系統中,神經元活動的增加會增加能量消耗以及細胞外腺苷濃度。在大腦大多數區域,細胞外高腺苷濃度作用于腺苷受體會降低神經元活性,從而降低能量需求。而在睡眠剝奪期間,腺苷濃度增加將會誘導睡眠,但在這一過程中也會阻止腺苷濃度增加從而取消恢復性睡眠。隨著研究的深入,糖原對睡眠的影響也逐步進入了研究者們的視線。Benington和Heller提出的理論指出,長時間清醒會導致大腦糖原儲存的消耗進一步導致睡眠需求的增加[41]。這一理論得到了大量實驗數據的支持,并引起了人們對星形膠質細胞調節睡眠的關注(糖原幾乎完全儲存在星形膠質細胞中)[42]。

2.3 失眠與脂質代謝 改變脂肪酸代謝會影響睡眠信號[43]。CRISPIM等[44]研究發現高脂肪攝入,特別是在晚餐,與睡眠效率降低、第一次快速眼動發作的時間延長、在第二階段睡眠花費時間延長,REM時間減少,以及在睡眠開始后醒來清醒的時間增加有關,而纖維攝入則與深度睡眠、恢復性睡眠有關。因此,保持富含纖維、低糖和其他非纖維碳水化合物的飲食可能是改善睡眠不良者睡眠深度和結構的有效方法[45]。睡眠時間的改變可以直接影響脂肪細胞釋放瘦素,從而改變饑餓的神經內分泌調節。研究表明,在睡眠期間,與對照組比較,睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive Sleep Apnoea,OSA)患者的游離脂肪酸顯著增加,并且這種增加在整個睡眠期間持續存在,尤其以NREM睡眠為主[46]。而兒童受試者比成人OSA受試者表現出更多與碳水化合物和氨基酸代謝異常相關的代謝產物。此外,成人OSA似乎與肥胖更相關,這可以解釋為什么脂代謝異常在成人中比在兒童OSA患者中更普遍[47]。脂質代謝途徑在OSA中已經凸顯其發現診斷標志物的潛能。如根據6種代謝產物(4-羥基戊烯酸、阿拉伯糖、甘鵝去氧膽酸-3-硫酸鹽、異亮氨酸、絲氨酸和黃嘌呤)的表達水平,可以將OSA患者與健康人區分開來,其敏感度和特異度分別為75%和78%[48]。提示這些差異性代謝物可能成為OSA的潛在標志物。代謝產物見圖2。

圖2 代謝產物在失眠中的網絡

3 代謝組學在失眠中的運用

3.1 失眠引起其差異物的改變,可能為失眠發病的潛在機制 失眠的發病機制主要涉及下丘腦-垂體-腎上腺軸、調節睡眠覺醒的神經遞質紊亂等方面[49-50]。通過上述氨基酸代謝與神經遞質的關系可以看出,代謝組學在闡述失眠的機制方面有一定的潛力,但是在揭示其機制方面可能還需要優化其實驗方案,以求弄清失眠是因,代謝產物變化是果,還是代謝產物變化是因,失眠是果。現有代謝組學在失眠方面的運用只能提示失眠會對氨基酸代謝通路、神經遞質代謝通路、糖脂代謝通路的代謝產物引起擾動,但具體能否揭示其機制,需要進一步驗證。如當缺失這些差異性代謝物時,能否引起失眠是驗證其發病機制的一個有效手段。失眠引起其差異性代謝產物的改變具體運用見表1。分析失眠患者及動物模型差異性代謝產物及其涉及通路發現,雖然失眠動物模型和失眠患者所涉及的通路基本相似,涵蓋氨基酸代謝通路和能量代謝通路,但是失眠患者還涉及脂質代謝通路,其中存在差異的原因可能為樣品選擇不同所造成(失眠模型選擇腦組織為樣品,而失眠患者主要選擇血清和血漿來進行檢測),但也可能是失眠發生的一條代謝通路。該結果提示在失眠的代謝組學研究中需要考慮種屬以及組織來源問題。而失眠患者之間比較,即使是來源相同的組織,其代謝產物也存在很大差異。此外,失眠患者代謝差異物的變化還與性別相關。由上可推知,失眠的代謝組學應該考慮性別之間的差異。而對于失眠患者代謝差異物的不同,在排除代謝組學測試處理結果的問題后,應該深層剖析挖掘其是否參與調控睡眠。

3.2 代謝組學在失眠中醫證型方面的運用 整體觀念、辨證論治是中醫診療的核心,而代謝組學的時相性、動態性、整體性和系統性等特點與中醫核心思想不謀而合[56]。非靶代謝組學注重人體的“態”,全面系統地反映現階段疾病的狀態、動態和態勢。而靶向代謝組學則能實現打靶,找到病證的特異性標志物。非靶與靶向結合能夠有助于證候模式的識別、有助于中醫學與現代醫學的結合,并且量化、統一中醫的一些感官評價模式[57]。中醫研究者將代謝組學運用到失眠的研究當中并取得了一些進展。失眠的中醫證型大致可分為肝郁化火證、肝郁脾虛證、心腎不交、心脾兩虛等。鄧丹丹等[58]通過比較肝郁化火證、痰火內擾證、陰虛火旺證3種證型的失眠患者的血液,發現精氨酸、甘氨酸、Phytosphingosine-1-P是其重要差異性代謝物。其中,Phytosphingosine-1-P是區分失眠肝郁化火證、痰火內擾證、陰虛火旺證3種證型之間的典型代謝產物,這或許是能成為這3種失眠證型的鑒別點。楊鈺涵等[59]通過腹腔注射對氯苯丙氨酸(P-chlorophenylalanine,PCPA)和多因素(四肢束縛、游泳、禁食、禁水、夾尾、明暗顛倒、電擊足底、鼠籠傾斜45°潮濕墊料)交互作用復制心腎不交證失眠動物模型,通過血清代謝組學分析其代謝產物,發現多因素共同作用方法復制的心腎不交與磷酸戊糖代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,組氨酸代謝,牛磺酸和亞牛磺酸代謝相關,多因素交互作用的心腎不交模型的3-亞磺酰苯胺和組氨酸含量升高以及其他指標升高提示該種模型更符合臨床失眠患者的特點。這或許提供更為可靠的心腎不交失眠證模型,為藥物研究提供模型基礎。見表2。

表2 針對中醫證型的失眠代謝組學研究

3.3 代謝組學在中醫藥防治失眠研究方面的應用 代謝組學對于理解藥效學、毒理物質基礎、作用機制及劑量和療程的確定具有重要的現實意義[63]。目前，對于失眠的代謝組學研究主要集中在藥物的作用機制以及藥效學研究，對于鎮靜催眠藥物毒理物質基礎以及機制、減毒問題、療程問題未涉及。而失眠患者往往以慢性失眠居多，需要長期服藥。因此需要在此方面展開研究。從表中看出，不同安神藥物的代謝通路多與氨基酸代謝通路相關，但部分藥物也有神經遞質、能量代謝、脂質代謝相關，其原因可能與藥物成分、作用靶點等方面相關。見表3。

表3 中醫藥防治失眠的代謝組學研究

4 討論

代謝組學作為一種研究工具,為動態觀察人體內的生理病理過程提供了便捷的方法。然而分析前階段的樣品選擇、收集、儲存和制備等變量可能會影響最終結果。因此,在實驗過程中首先要保證標本的可靠性,以獲得高質量數據。此外,代謝組學需要復雜的數據統計技術,尤其是在小樣本情況下[74]。數據的統計過度擬合可能會導致錯誤,因此需要多組學相互驗證以求更加準確的結果[75]。

利益沖突聲明:無。