MYBL2在淋巴結(jié)陽(yáng)性前列腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)雄激素剝奪治療結(jié)局的預(yù)測(cè)作用

付國(guó),程繼,高丹

(陜西省人民醫(yī)院 泌尿外科,陜西 西安 710068)

前列腺癌(PCa)是一種高度異質(zhì)性腫瘤,盡管在診斷和治療策略方面取得了巨大進(jìn)步,但它仍是男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。根治性前列腺切除術(shù)(RP)是局部晚期PCa的一線治療選擇之一[2]。在接受RP和盆腔淋巴結(jié)清除術(shù)(PLND)的所有PCa患者中,部分患有病理性淋巴結(jié)陽(yáng)性(LNP)疾病,LNP與預(yù)后不良密切相關(guān)[3]。對(duì)于LNP-PCa患者,指南建議輔助雄激素剝奪治療(ADT)[4]。然而,ADT的耐藥性仍然是一個(gè)臨床挑戰(zhàn)。因此,有必要更好地了解耐藥性的驅(qū)動(dòng)因素,以制定為L(zhǎng)NP-PCa患者提供長(zhǎng)期臨床益處的治療策略。能及早預(yù)測(cè)LNP并識(shí)別對(duì)ADT反應(yīng)的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。骨髓母細(xì)胞增生癥病毒癌基因同源樣蛋白2(MYBL2)是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,在細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞生存和惡性轉(zhuǎn)化中起重要調(diào)節(jié)作用。事實(shí)上,MYBL2基因在許多癌癥中過(guò)度表達(dá),并與患者預(yù)后不良相關(guān)[5]。MYBL2可以通過(guò)調(diào)節(jié)雄激素依賴性PCa細(xì)胞中Rho-GTPasesRhoA和LATS1激酶的活性來(lái)促進(jìn)YAP1轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而促進(jìn)去勢(shì)耐藥性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力[6]。因此測(cè)定MYBL2表達(dá)水平可能會(huì)影響LNP-PCa的治療選擇。本研究旨在檢測(cè)MYBL2在PCa組織中的表達(dá)水平,并調(diào)查其與LNP-PCa患者臨床病理特征和ADT輔助治療預(yù)后的關(guān)系,最后進(jìn)行生存分析以評(píng)估該生物標(biāo)志物的預(yù)后預(yù)測(cè)潛力。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

經(jīng)我院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn),共使用80份PCa標(biāo)本和36份良性前列腺增生(BPH)標(biāo)本進(jìn)行回顧性分析。兩個(gè)隊(duì)列的研究參與者均簽署知情同意書(shū)。PCa標(biāo)本是于2017年2月至2022年6月期間在我院接受RP的PCa患者中采集的,患者年齡48～82歲,平均(66.09±6.45)歲,術(shù)前血清前列腺特異性抗原(PSA)水平為23.85 ng·ml-1[四分位間距(IQR)13.74～47.89 ng·ml-1]。納入標(biāo)準(zhǔn):(1) 經(jīng)病理活檢證實(shí)為PCa,病理學(xué)樣本由泌尿生殖病理學(xué)專家審查;(2) 部分LNP-PCa患者在術(shù)后接受了輔助性ADT,最多曾接受過(guò)1次細(xì)胞毒性化療、放療或免疫治療,前提是這些治療在ADT開(kāi)始前4周停止;(3) 東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)表現(xiàn)狀態(tài)≤2分,符合血液學(xué)和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn),包括血清鉀≥3.5 mmol·L-1,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)<1.5倍正常上限(ULN),血清總膽紅素≤1.5倍ULN,左心室射血分?jǐn)?shù)≥50%;(4) 有至少6個(gè)月的隨訪數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn):患者可能曾接受過(guò)任何數(shù)量的激素治療(包括抗雄激素、類固醇、雌激素、非那雄胺、度他雄胺和酮康唑);合并無(wú)法控制的并發(fā)癥、肝病、垂體或腎上腺功能障礙;入組前6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)過(guò)臨床顯著的心血管事件或血栓栓塞以及可能干擾藥物吸收的胃腸道疾病;治療開(kāi)始后1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行手術(shù)或局部前列腺介入治療;治療后隨訪失敗。作為良性對(duì)照,從因癥狀性BPH而接受經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)(TURP)的患者中采集了36份冷凍的良性前列腺標(biāo)本,患者年齡43～81歲,平均(65.53±10.34)歲,血清PSA水平為4.56 ng·ml-1(IQR 1.89～8.36 ng·ml-1)。

1.2 治療及隨訪

所有PCa患者均接受RP作為初始治療。64例患者(80.0%)接受了機(jī)器人輔助腹腔鏡前列腺切除術(shù),16例患者(20.0%)接受了經(jīng)恥骨后RP。27例經(jīng)病理證實(shí)LNP的患者接受了局限性或擴(kuò)大PLND,術(shù)后進(jìn)行輔助性ADT,接受阿比特龍(1 000 mg·d-1)和潑尼松(5 mg·d-1)治療2個(gè)4周療程后,加入高劑量度他雄胺(3.5 mg·d-1),直到研究退出或疾病進(jìn)展。根據(jù)醫(yī)生的判斷,患者接受定期PSA監(jiān)測(cè)和診斷成像[腹部和骨盆的計(jì)算機(jī)斷層掃描和(或)骨盆的磁共振成像,以及骨骼掃描]。

1.3 回顧性資料收集

回顧性收集臨床和病理數(shù)據(jù),包括患者年齡、首次診斷日期、診斷時(shí)的基線Gleason評(píng)分(GS)和PSA、進(jìn)展和死亡日期(如有)。生化復(fù)發(fā)(BCR)定義為手術(shù)后兩次連續(xù)測(cè)量的PSA值大于0.2 ng·ml-1。臨床進(jìn)展(CP)定義為隨訪期間X線檢查證實(shí)的疾病(局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)。無(wú)進(jìn)展生存(PFS)時(shí)間定義為從ADT治療開(kāi)始到BCR、CP或死亡的時(shí)間,或報(bào)告患者存活且無(wú)疾病進(jìn)展的最后隨訪日期。

1.4 免疫組化檢測(cè)

用二甲苯和分級(jí)醇對(duì)5 μm厚的福爾馬林固定石蠟包埋組織切片進(jìn)行脫蠟,并用3%H2O2淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。將載玻片與MYBL2一級(jí)抗體(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)以1∶500的比例孵育。二級(jí)抗體以1∶300的比例稀釋后額外避光孵育1 h。用奧林巴斯CX41RF顯微鏡拍攝抗體標(biāo)記照片。在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中觀察MYBL2的陽(yáng)性染色。每次評(píng)估隨機(jī)選擇5個(gè)視野,并以400倍放大率觀察(每個(gè)視野至少有200個(gè)細(xì)胞)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比(陰性為0分,<10%為1分,10%～50%為2分,51%～80%為3分,>80%為4分)和染色強(qiáng)度(陰性為0分,弱為1分,中等為2分,強(qiáng)烈為3分)的乘積表示免疫反應(yīng)性評(píng)分(IRS),最終IRS 0～1分被視為陰性,IRS≥2分被認(rèn)為陽(yáng)性。

1.5 TCGA前列腺癌數(shù)據(jù)挖掘

泛癌和基因型-組織表達(dá)(GTEx)數(shù)據(jù)庫(kù)的MYBL2基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自TIMER2.0(http:∥timer.comp-genomics.org/)。PCa數(shù)據(jù)集(551個(gè)樣本,轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù))的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息來(lái)自癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)。利用DESeq2包探索mRNA的差異表達(dá)。調(diào)整后的P<0.05和|log2(倍數(shù)變化)|>1作為篩選差異表達(dá)基因(DEG)的閾值,用于糾正假陽(yáng)性結(jié)果。應(yīng)用“pROC”和“timeROC”軟件包評(píng)估MYBL2的診斷價(jià)值,并通過(guò)受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析和比較MYBL2的診斷性能。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中,根據(jù)MYBL2 mRNA表達(dá)的中位值將PCa患者分為兩組,利用R包“生存”分析兩組的生存數(shù)據(jù),并通過(guò)R包“surviminer”描繪生存曲線(選擇“Kaplan-Meier”)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R(3.5.2版)和GraphPad Prism(8.00版)軟件。連續(xù)變量描述為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,并行獨(dú)立t檢驗(yàn)比較2組間數(shù)據(jù)差異。通過(guò)卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析非連續(xù)變量。通過(guò)生存曲線和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析MYBL2在預(yù)測(cè)接受ADT的LNP-PCa患者PFS中的風(fēng)險(xiǎn)比(HRs)。進(jìn)行多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析,包括GS、RP切緣和MYBL2蛋白表達(dá)作為協(xié)變量。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織MYBL2蛋白表達(dá)

MYBL2蛋白陽(yáng)性染色呈黃棕色或棕色顆粒,位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。PCa組織中陽(yáng)性表達(dá)36例(45.0%),陰性表達(dá)44例(55.0%);BPH組織中陽(yáng)性表達(dá)4例(11.11%),陰性表達(dá)32例(88.89%),兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.171,P<0.001,圖1)。

圖1 免疫組化分析MYBL2蛋白在BPH組織和高分化PCa組織中的表達(dá)情況(×400)

2.2 PCa組織MYBL2蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

在PCa組患者中,組織MYBL2蛋白表達(dá)只與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),LNP-PCa患者中組織MYBL2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(63.64%,21/33)高于非LNP-PCa患者(31.91%,15/47,P=0.005)。未觀察到PCa組織MYBL2蛋白表達(dá)與年齡、體重指數(shù)、PCa家族病史、腫瘤GS分級(jí)、組織學(xué)分級(jí)、pT分期RP切緣及基線血清PSA水平之間的關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 PCa患者組織MYBL2蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 例

2.3 組織MYBL2蛋白表達(dá)與LNP-PCa患者ADT治療結(jié)局的關(guān)系

27例接受ADT的LNP-PCa患者,RP術(shù)后血清PSA水平最低值均≤0.05 ng·ml-1。術(shù)后輔助ADT中位持續(xù)時(shí)間為17.6個(gè)月(IQR 11～26個(gè)月),中位隨訪時(shí)間為33.0個(gè)月(IQR 28～40個(gè)月)。隨訪期間17例患者發(fā)生BCF,其中9例發(fā)生CP(包括1例局部復(fù)發(fā)和8例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)。繪制Kaplan-Meier生存曲線,MYBL2陽(yáng)性表達(dá)者中位PFS時(shí)間短于MYBL2陰性表達(dá)者(30.0個(gè)月vs. 64.0個(gè)月,Log-rankχ2=19.135,P<0.001),見(jiàn)圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析接受ADT治療LNP-PCa患者的PFS

2.4 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

經(jīng)單因素分析,腫瘤GS分級(jí)、組織MYBL2蛋白表達(dá)與LNP-PCa患者ADT治療后PFS有關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表2。將單因素分析中P<0.01的變量包括腫瘤GS分級(jí)、RP切緣、組織MYBL2蛋白表達(dá)納入多因素分析模型,結(jié)果顯示,組織MYBL2蛋白表達(dá)仍然是影響PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P=0.002),見(jiàn)表3。

表2 單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析影響LNP-PCa患者PFS的臨床因素

表3 多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析影響LNP-PCa患者PFS的臨床因素

2.5 生物信息學(xué)分析

分析GTEx和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的RNA-seq數(shù)據(jù),結(jié)果表明,與正常樣本相比,19例PCa組織樣本(n=499)中MYBL2 mRNA水平較高(P<0.001,圖3A)。未配對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)分析表明,PCa組織中MYBL2mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.001,圖3B);配對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,在52例PCa組織中MYBL2水平亦顯著高于相匹配的癌旁組織(P<0.001,圖3C)。此外MYBL2 mRNA高表達(dá)與更短的PFS顯著相關(guān)(P<0.001,圖3D)。

3 討 論

近年來(lái),PCa已成為我國(guó)男性第六常見(jiàn)的惡性腫瘤,死亡率也高居前四位[7]。PCa在臨床上具有異質(zhì)性,大多數(shù)疾病進(jìn)展緩慢,但仍有部分患者可迅速發(fā)展為骨和LNP,并對(duì)ADT產(chǎn)生耐藥性,缺乏有效治療。LNP是局部晚期患者死亡的主要原因[8-9]。PCa的分子異質(zhì)性是臨床異質(zhì)性的根本原因之一[10],迄今為止的研究尚未系統(tǒng)地解決這一問(wèn)題。在本研究中,我們將MYBL2假定為PCa的潛在生物標(biāo)志物,并研究了他與PCa患者臨床病理特征以及預(yù)后之間的相關(guān)性。

MYBL2,也稱為B-myb,是骨髓母細(xì)胞增生癥家族的一種轉(zhuǎn)錄因子。它最初被鑒定為v-myb癌基因的細(xì)胞同源物,該癌基因已知會(huì)導(dǎo)致雞白血病[11]。MYBL2蛋白是由704個(gè)氨基酸組成的,它們形成“SWI3、ADA2、N-CoR和TFIIIB”(SANT)DNA結(jié)合域、反式激活域(TA)、保守區(qū)(CR)和調(diào)節(jié)域(RD)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和CR幾乎與A-MYB和C-MYB相同,并且在不同物種(包括人、動(dòng)物、線蟲(chóng)等)之間具有高度保守性[12-13]。與A-MYB(主要在B細(xì)胞、發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、胚胎中的有絲分裂活性細(xì)胞和生殖組織中表達(dá))和C-MYB(在造血前體細(xì)胞中表達(dá))不同,MYBL2在所有增殖細(xì)胞中都有表達(dá)[14]。從功能上講,MYBL2在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、增殖細(xì)胞分化和細(xì)胞周期進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。據(jù)報(bào)道[6,16],miR-30a可以通過(guò)靶向MYBL2抑制PCa的雄激素非依賴性生長(zhǎng);并通過(guò)調(diào)節(jié)Hippo-YAP信號(hào)通路控制PCa去勢(shì)抵抗和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的發(fā)展。此外,其他一些與癌癥相關(guān)的結(jié)果[17-20]表明,MYBL2在乳腺癌、肝癌、卵巢癌和皮膚T淋巴瘤中明顯擴(kuò)增,其表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)。基于這些數(shù)據(jù),我們有理由相信MYBL2可能在PCa的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本研究中,我們首先通過(guò)IHC檢測(cè)證實(shí)MYBL2蛋白在PCa組織中陽(yáng)性表達(dá)率為45.0%,顯著高于BPH組織,且PCa組織MYBL2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),LNP-PCa患者中組織MYBL2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于非LNP-PCa患者(58.33%vs. 27.27%,P=0.005)。

之前的幾項(xiàng)研究[2-4,9]表明,接受RP作為初始治療的PCa患者中,LNP與預(yù)后不良相關(guān)。然而目前對(duì)于LNP-PCa患者的最佳管理仍不清楚。國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南描述了LNP患者輔助治療的幾種選擇,即ADT、臨床觀察或在ADT基礎(chǔ)上增加盆腔外照射治療(RT)。而且與LNP疾病的延遲ADT相比,建議立即給予ADT作為輔助治療[21]。然而分子異質(zhì)性導(dǎo)致LNP-PCa患者接受ADT的治療結(jié)局不盡相同。

識(shí)別有BCR風(fēng)險(xiǎn)的患者對(duì)于指導(dǎo)輔助治療,從而改善預(yù)后至關(guān)重要。目前臨床上主要依靠醫(yī)生的判斷,以及腫瘤本身的風(fēng)險(xiǎn)分層來(lái)觀察結(jié)果,缺乏有效的預(yù)后標(biāo)志物。在本研究中,根據(jù)Kaplan-Meier曲線和多變量Cox回歸分析,我們發(fā)現(xiàn)組織MYBL2蛋白表達(dá)是影響LNP-PCa患者接受ADT后BCR風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,組織MYBL2陽(yáng)性表達(dá)與更短的PFS相關(guān);這一事實(shí)證明了PCa組織中MYBL2表達(dá)升高的臨床相關(guān)性,因此我們有理由認(rèn)為MYBL2是LNP-PCa的預(yù)后標(biāo)志物之一,但作為治療選擇的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物尚不成熟。本研究在患者中的觀察數(shù)據(jù)與既往的體外細(xì)胞系研究基本一致,例如,在AR陽(yáng)性LNCaP細(xì)胞系中,沉默MYBL2表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)雄激素剝奪和紫杉醇的敏感性。此外,MYBL2的過(guò)度表達(dá)可以通過(guò)調(diào)節(jié)Rho-GTPasesRhoA和LATS1激酶的活性來(lái)促進(jìn)YAP1轉(zhuǎn)錄活性,從而促進(jìn)雄激素依賴性PCa細(xì)胞的去勢(shì)耐藥性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力;重要的是,靶向MYBL2可逆轉(zhuǎn)PCa細(xì)胞對(duì)ADT的抵抗,并阻斷了PCa細(xì)胞在體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)移[6,22]。總之,MYBL2是一種PCa細(xì)胞系A(chǔ)DT耐藥的候選分子機(jī)制。

研究癌癥基因的分子機(jī)制是一項(xiàng)長(zhǎng)期的探索。不同腫瘤中基因的分子機(jī)制受到復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的影響。公共數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA和GTEx的使用讓?xiě)?yīng)用生物信息學(xué)工具進(jìn)行癌癥分析成為可能。我們認(rèn)為MYBL2可能是LNP-PCa診斷和預(yù)后的有效生物標(biāo)志分子之一。因此最后我們使用了大規(guī)模的數(shù)據(jù)庫(kù)資源和統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)一步系統(tǒng)地證明MYBL2是PCa惡性進(jìn)展中的不良預(yù)后因素。我們分析了GTEx和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MYBL2mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)MYBL2在包括PCa在內(nèi)的許多腫瘤組織中表達(dá)上調(diào);且MYBL2 mRNA表達(dá)上調(diào)與較差的PFS呈正相關(guān),本研究結(jié)果與之基本一致。

本研究的結(jié)果表明,PCa組織MYBL2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于良性BPH組織,且在LNP-PCa患者的腫瘤組織中MYBL2陽(yáng)性表達(dá)率更高。此外,MYBL2也是接受RP和ADT治療的LNP-PCa患者中生化復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。總之,MYBL2可能是PCa中一種新的腫瘤生物標(biāo)志物,與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及LNP-PCa患者的預(yù)后相關(guān),這為臨床靶向治療策略的發(fā)展提供了新的機(jī)會(huì)。MYBL2在促進(jìn)PCa進(jìn)展中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充。