線粒體自噬在敵草快中毒腎近曲小管損傷中保護作用的研究進展

楊登會,羅瀾,劉小露,胡杰,吳瑾,賴福平,陸安靜,喻安永,王瑞烈,2,陸元蘭,2

(遵義醫科大學附屬醫院 1.急診科,2.門診部,貴州 遵義 563003)

自我國禁用百草枯(paraquat, PQ)以來,敵草快(diquat, DQ)作為一種速效除草劑廣泛應用于農業[1-2],化學名稱為1,10-乙烯-2,20-聯吡啶陽離子,分子式為C12H10Br2N2。近年來,DQ中毒患者逐年增多,急性口服DQ中毒成為我國急診科常見的急危重癥之一。DQ通過主動或被動攝入后主要經腎臟、消化道等途徑排出,在腎臟中含量最高[3-6]。臨床上,DQ中毒患者可表現為腎臟、肝臟、肺臟、中樞、心臟等多器官功能損傷或衰竭,尤以腎臟損害較為突出,DQ毒代動力學及氧化還原循環反應也證實腎臟是主要排泄器官及損傷靶點[7-9]。此外,腎臟組織學分析亦表明,DQ中毒致腎損傷的主要靶點是近曲小管[10]。目前,DQ中毒的機制尚未完全明確,缺乏特效解毒劑,重癥患者治療效果欠佳、病死率高。而DQ中毒致腎近曲小管損傷可延緩毒物排泄,進一步加重全身多器官功能損傷,使患者預后更差,并發癥更多[8]。因此,進一步探索DQ中毒誘導腎近曲小管損傷的機制具有重要意義,盡早改善腎功能有益于改善疾病的預后及轉歸。

現有研究表明,DQ中毒機制可能與氧化/抗氧化失衡、炎癥反應、氧自由基損傷、細胞的網絡激活及細胞凋亡等相關[1-2]。DQ作為一種強氧化劑,通過觸發氧化應激產生過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),致線粒體功能障礙,使腎近曲小管上皮細胞凋亡,進而誘導腎近曲小管細胞毒性。其中線粒體既是氧化應激后細胞內ROS的主要來源,也是ROS損害的重要靶點。過量的ROS可誘導線粒體內穩態失衡,致線粒體功能障礙[11]。相反,DQ中毒所產生的過量ROS可通過誘導線粒體膜去極化,觸發線粒體自噬,以清除受損或冗余的線粒體并維持線粒體內穩態平衡,從而減輕急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)。目前,關于線粒體自噬如何減輕DQ中毒后AKI的具體機制尚未完全明確,本文作者將對線粒體自噬在DQ中毒致腎近曲小管損傷中的保護作用予以綜述。

1 DQ中毒導致腎近曲小管線粒體氧化損傷

腎臟作為DQ蓄積的主要部位及排泄的主要通道,是DQ中毒的主要靶器官之一。臨床上,重癥DQ中毒患者往往易并發AKI,盡管現有治療措施如血液透析等可清除毒素及水分、調節電解質平衡,從而緩解AKI,但因缺乏DQ特效解毒劑,仍有部分病人可遺留急性腎衰竭(ARF)等并發癥,預后差。因此,進一步探索DQ中毒后AKI治療的新策略有助于提高患者生存率及生活質量,減輕社會負擔[12]。現有研究表明,DQ中毒致AKI可能與以下兩點相關:一方面,DQ中毒誘導的氧化應激可產生過量的ROS,致線粒體功能障礙,促使腎近曲小管上皮細胞凋亡;另一方面,研究發現DQ主要蓄積于腎臟近曲小管上皮細胞,且DQ的分子結構與腎毒素(奧萊毒素)相似都具有腎臟毒性,從而致腎近曲小管功能損傷,但其具體機制有待進一步研究[12-13]。線粒體是調節細胞能量代謝平衡的關鍵細胞器,在細胞代謝、氧化應激、細胞凋亡中發揮關鍵作用[14]。線粒體作為一種防御機制,其內穩態在能量代謝中起核心作用,是細胞內ROS產生的主要來源,也是ROS損傷時作用的重要靶點[15]。DQ中毒后誘導的氧化應激致過量的ROS及活性氮(reactive nitrogen species, RNS)產生,而當線粒體內ROS累積到最大閾值時可觸發線粒體內膜的陰離子通道開放,使線粒體基質釋放大量ROS,導致腎近曲小管線粒體氧化損傷。由此可見,線粒體氧化損傷與DQ中毒致腎近曲小管損傷的發生密切相關。

1.1 DQ中毒誘導氧化應激及線粒體損傷

DQ中毒打破氧化還原平衡使ROS過量產生,致使腎近曲小管上皮細胞內穩態失衡,激活細胞內的炎癥信號通路,誘導氧化應激,損害線粒體功能,使ROS過量產生致線粒體膜去極化,導致細胞功能障礙,DQ中毒后引起氧化應激、缺血缺氧損傷等損害腎近曲小管上皮細胞,導致其壞死,最終使腎臟排泄功能急劇下降,毒性物質進一步堆積,導致惡性循環。研究表明,氧化還原電位值(redox potential, E0)作為衡量電子親和力的最佳指標,DQ主要以擴散的形式通過細胞膜進入腎近曲小管上皮細胞,因DQ中含有相對較高的E0,因此DQ中毒導致的氧化應激損害程度嚴重[16]。在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和細胞色素還原酶(P450)的作用下,DQ中毒通過氧化還原循環過程將高度不穩定DQ自由基上的電子NADP+和陽離子自由基(DQ+.)轉移給分子氧(O2),產生大量超氧化物陰離子自由基(O2.+),同時DQ+.失去一個電子轉化為DQ2+,通過連續不斷的循環氧化還原過程產生大量的O2.+[17],與O2發生反應產生 H2O2和O2,最終使腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)合成過程中斷及細胞死亡途徑激活。氧化應激的重要性現已被普遍證實[18-19],是造成繼發性線粒體損傷的主要原因,損傷后的線粒體使細胞內能量供應顯著降低、ROS生成明顯增加,兩者均為加重DQ中毒后繼發性腎損傷的重要因素。因此,DQ中毒引起線粒體損傷的機制與中毒誘導的氧化應激水平增強之間存在密切的關系。

1.2 DQ中毒致線粒體損傷與腎近曲小管損傷

腎臟是富含線粒體、能量消耗最高的器官之一,通過線粒體產生的ATP維持基本功能[20]。腎臟不同腎單位節段的能量需求及線粒體密度不同,其中腎近曲小管通過機體高能量供應來對抗化學梯度以發揮重吸收及分泌功能,故腎近曲小管中富含產ATP的線粒體[21]。線粒體功能障礙導致ATP生成減少、細胞結構改變、腎功能喪失,在DQ中毒腎臟疾病進展中發揮重要作用。DQ中毒所致的AKI發生率較高,腎近曲小管上皮細胞是其損傷的關鍵靶細胞,而線粒體損害在其間發揮重要的作用。據報道,DQ中毒后誘導氧化應激致腎近曲小管線粒體清除ROS的能力低下,致使ROS堆積,過高的ROS水平通過抑制線粒體氧化磷酸化過程下調細胞色素C(cytochrome C, cytC)氧化酶活性,最終導致線粒體功能障礙,表現為線粒體ROS生成增加、膜電位降低、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性降低、丙二醛(malondialdehyde, MDA)濃度升高[22];另外也有研究發現,DQ中毒引起的AKI可通過開放介導線粒體基質及細胞質之間的信號轉導通路或物質傳遞的非特異通道線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability pransition pore, mPTP),進而啟動線粒體通透性轉變,導致氧化應激、Ca+毒性,增加促凋亡介質的釋放,從而損傷線粒體功能、誘導腎近曲小管上皮細胞凋亡[21]。因此,線粒體是AKI發病機制的中心環節,線粒體損傷在DQ中毒致腎近曲小管氧化損傷中發揮重要作用。

2 線粒體損傷與線粒體自噬的相關性

線粒體損傷是DQ中毒后AKI的主要機制之一,線粒體的氧化應激、能量代謝障礙、自噬異常等是引起線粒體損傷的重要原因。線粒體自噬是巨自噬的一種,損傷的線粒體由自噬膜包裹形成自噬體,而后與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而被降解吞噬。這種方式可以保證線粒體的質量,減少損傷的線粒體釋放過多的ROS、促凋亡物質等,避免對細胞造成進一步的損傷。DQ中毒誘導氧化應激致使ROS 大量聚積于線粒體內膜,導致線粒體受損及腎近曲小管上皮細胞凋亡,機體為了應對氧化應激及線粒體損傷,在線粒體膜去極化時觸發了自噬。在近曲小管上皮細胞受損之前,線粒體自噬作為機體的自我防御機制,能選擇性地隔離并降解掉功能失調的線粒體[23],從而阻斷過量ROS的產生。線粒體自噬可通過自噬小體特異性吞噬降解受損線粒體,在維持細胞內穩態中具有重要意義。研究發現氧化應激、細胞器損傷等可通過誘導線粒體融合與裂變失衡,激活線粒體自噬,導致腎臟疾病的發生與發展[24]。因此,線粒體融合與裂變失衡是線粒體自噬發生的先決條件,線粒體自噬激活主要表現為線粒體及自噬相關基因(autophagy-related gene,ATG) 上游蛋白在自噬小體形成位點處聚集,Parkin泛素化受損線粒體。泛素化的線粒體及ATG 上游蛋白與自噬小體形成位點相互作用后,受損線粒體通過微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3) 與自噬小體結合并被降解掉。線粒體自噬的激活是線粒體對氧化應激損傷的關鍵適應性反應,主要由受體非依賴性機制調節,該機制基于PTEN 假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)/E3泛素連接酶Parkin誘導的有絲分裂通路、Bcl-2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3/Nip3 樣蛋白X通路和 FUN14結構域蛋白 1(FUN14 domain-containing protein 1, FUNDC1)通路發揮作用[25]。因此,腎組織線粒體內穩態依賴于自噬清除功能障礙線粒體。

3 線粒體自噬在DQ中毒腎近曲小管損傷中的保護作用

DQ誘導氧化應激后觸發的線粒體自噬具有腎臟保護作用[26],在清除DQ誘導的受損線粒體過程中,觀察到有絲分裂相關自噬蛋白的表達上調,如Pink1、Parkin、LC3-II和LC3-I表達增加[27];AKI 時近端腎小管上皮細胞中自噬現象增多,表現為自噬相關蛋白表達增多、自噬流的暢通、電鏡下自噬體形成增多。證實在自我防御的基礎上機體能在受損線粒體損傷腎小管之前選擇性清除、吞噬功能障礙線粒體,說明線粒體自噬能對抗腎近端小管上皮細胞中的線粒體代謝應激及DQ中毒所致AKI[28],最終發揮腎臟保護的作用[29]。研究發現,在缺血再灌注腎損傷中PINK1/Parkin介導的線粒體自噬增多,通過特異性敲除自噬蛋白能顯著增加線粒體損傷、ROS產生,使肌酐升高、腎小管損傷評分增加、細胞凋亡增加,腎損傷明顯加重[30],證實線粒體自噬在缺血再灌注損傷所致AKI的病理生理條件下,在線粒體動力學、腎小管上皮細胞及腎功能保護中扮演重要角色。激活線粒體自噬以清除受損線粒體是線粒體對DQ中毒后氧化應激損傷的關鍵適應性反應,FUNDC1為哺乳動物細胞內新型線粒體自噬相關受體,生理條件下,FUNDC1在腎小管中表達豐富,在介導線粒體自噬激活過程中發揮重要作用[31],FUNDC1通過LC3相互作用區(LC3-interacting region, LIR)結構域與LC3相互作用,募集自噬膜泡后包裹線粒體以選擇性介導線粒體自噬。現有不少學者推論,DQ中毒致腎近曲小管線粒體功能障礙,誘導氧化應激刺激后可能通過激活FUNDC1依賴性的線粒體自噬以減輕中毒所致的AKI,可望為臨床DQ中毒患者提供治療新靶點。

4 線粒體靶向治療及線粒體自噬在DQ中毒中的新思路

DQ中毒目前尚無特效解毒劑,故其病死率高,預后差。與PQ相比,DQ中毒后腎損害較重而肺纖維化較輕,因為DQ中毒毒性主要蓄積于腎臟。DQ中毒導致AKI,與ROS依賴性腎近曲小管上皮細胞凋亡密切相關,主要為腎近曲小管線粒體清除ROS能力低下,導致ROS累積,進而導致線粒體功能障礙。研究表明,在該過程中通過外源性補充線粒體靶向抗氧化劑-mitoTEMPO/質體醌基癸基三苯基鏻的類似物10-(6′-plastoquinonyl) decylrhodamine-19(SkQR1)能起到腎臟保護的作用[32-33]。過氧化物酶體增殖物受體共激活因子1α(proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α)是線粒體生物合成的主要調節因子,高度表達于腎臟近端小管中,與其他因子共同作用促進線粒體生物合成,研究證實,腎臟中PGC-1α的表達水平與中毒后AKI的嚴重程度呈負相關,過表達PGC-1α-線粒體生物合成激活劑-AMPK激活劑、 AICAR、SIRT1激動劑SRT1720和白藜蘆醇等,可以促進AKI的腎臟修復過程[34]。同時研究證實,中毒后線粒體裂變/融合失衡,過度裂變致使線粒體破裂,通過抑制裂變過程-線粒體裂變/線粒體自噬抑制劑(Mdivi-1)及特異性敲除腎近曲小管線粒體裂變的關鍵因子-線粒體動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp 1)可以保護小鼠免受DQ中毒后誘導的腎小管細胞凋亡及腎臟損害。研究發現,鈣調磷酸酶抑制劑(環孢素A)(cyclosporin A, CsA)作為mPTP的強效抑制劑[35],低劑量CsA通過抑制mPTP開放,進而改善線粒體腫脹、恢復線粒體功能,從而減輕腎細胞損傷[36]。mTOR 抑制劑雷帕霉素上調自噬以減輕AKI,但具體機制尚未明確。以上結果表明,DQ中毒后通過外源性抗氧化治療、線粒體自噬激活劑、過表達線粒體生物合成、抑制mPTP等過程的相互作用,最終減輕中毒所導致的AKI。

綜上,DQ中毒誘導線粒體自噬以減輕氧化應激所致的腎臟線粒體氧化損傷,線粒體自噬的靶向抗氧化劑及促有絲分裂激動劑對DQ中毒所致的腎臟損害具有保護作用。通過自噬可以減輕DQ中毒致腎臟損害的氧化應激反應程度、修復受損線粒體形態及功能,最終改善DQ中毒的腎功能預后。應進一步探究線粒體自噬及線粒體抗氧化治療具體機制,以期為DQ中毒致腎近曲小管損傷的合理化、規范化、系統化治療提供臨床依據。