白藜蘆醇協同多黏菌素B對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌的體外抗菌活性研究〔1〕

鐘 春,黃遠虹,張裕芳,賴慧娟

(廣東省人民醫院贛州市立醫院,江西 贛州 341000)

在目前加強抗菌藥物使用的大背景下,多黏菌素等新型藥物逐步應用于臨床,被認為是治療耐碳青霉烯腸桿菌(CRE)感染的最后防線[1-3]。控制抗菌藥物的使用量、減少抗菌藥物選擇壓力是控制細菌耐藥性發展的主流要求[4-5]。所以,對聯合應用抗菌藥物采取慎重態度尤為重要。碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌的感染性和耐藥性逐年上升,針對該病原菌的治療是臨床尤其是重癥感染患者救治的難點[5]。多黏菌素B是強效抗生素,在防微生物感染中發揮重要作用,并且是宿主免疫反應的關鍵效應物[6-8]。白藜蘆醇是發現于植物中的一大類生物活性物質,廣泛存在于葡萄、花生等植物中,其潛在治療優勢受到醫療領域的廣泛關注[9]。有研究表明[10],白藜蘆醇中提取的活性成分具有一定的抗菌能力,可顯著增強慶大霉素、阿米卡星等藥物的抗菌作用。本研究從臨床選取100 株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌,探討白藜蘆醇能否增強多黏菌素B在體外的抗菌活性,為臨床診療及合理選用抗菌藥物提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究所用菌株均從臨床樣本中分離而來,100 株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌包括CRE38 株、耐碳青霉烯銅綠假單胞菌(CRPA)22 株、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)40 株。本研究已獲得我院倫理委員會審批,涉及患者均獲得書面知情同意書。

1.2 試劑制備

白藜蘆醇與多黏菌素B均購自北京索萊寶科技有限公司。將白藜蘆醇與多黏菌素B分別于去離子水、二甲亞砜(DMSO)中溶解,制備濃度為10 mg/mL,100 mg/mL的試驗試劑,用醋酸纖維素(上海源葉生物科技有限公司)0.2 μm注射過濾器進行滅菌。將所制配原液儲存于-20 ℃環境中,保存時間不超過1 個月。

1.3 方法

1.3.1 最低抑菌濃度測定

采用肉湯微量稀釋方式對抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)進行測定。選Mueller-Hinton肉湯(采購自北京索萊寶科技有限公司)新鮮制備在96 孔微量滴定板中測MIC。設定細菌樣本最終體積200 μL,濃度5×105CFU/mL,于37 ℃孵育24 h后目視讀取微量滴定板數值記錄結果。整個實驗流程均參照2017年美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準。設定敏感為MIC≤2 μg/mL,耐藥為MIC≥4 μg/mL。

1.3.2 棋盤試驗

選96 孔無菌微孔板實施棋盤稀釋測定。每種抗菌藥物都用無菌Mueller-Hinton肉湯稀釋至最大濃度為藥物MIC濃度的2 倍,通過稀釋制備每種藥物8 個濃度,將50 μL適當藥物與100 μL細菌溶液(予5×105CFU/mL最終接種物)稀釋至板孔中。MIC為無細菌生長最低藥物濃度,根據MIC值計算出抑菌濃度指數(FIC),通過FIC評估藥物間協同作用。FIC指數=FIC(藥物A)+FIC(藥物B),其中FIC=MIC(聯合)/MIC(單獨)。FIC判讀:FIC指數在0.5以內(含0.5)為具有協同效應,FIC指數超過4.0為具有拮抗作用,FIC指數為0.5～4.0范圍內(不含0.5)為無相互作用。

1.3.3 抑菌率曲線測定

采用微孔板生物監測法,于96 微孔板取3 微孔為對照孔,每孔內裝200 μL無菌培養液,再取3孔裝200 μL濃度1.5×1010CFU/mL細菌培養液,其他孔設為樣品測定孔,于測定孔內加入200 μL 1.5×1010CFU/mL細菌培養液,再依次加入10 μL不同濃度藥物,在37 ℃下培養16 h,酶標儀測波長600 nm微孔板中培養液吸光度(A)值,計算孔內樣品抑菌率。抑菌率(%)AR-A/AR-AB×100%。(AR為菌液對照孔吸光度值;AB為空白對照孔吸光度值;A為樣品測定孔吸光度值)。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 細菌分離物

選取100 株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌,主要包括CRE 38 株、CRPA 22 株、CRAB 40 株。其中53 株來自呼吸內科(53%),37 株來自重癥醫學科(37%),6 株來自神經外科(6%),4 株來自神經內科(4%)。

2.2 多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯合對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌的MIC值

通過監測多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯合對CRE,CRPA,CRAB抗菌效果可知,各菌株對白藜蘆醇的MIC值均在512 μg/mL以上。加入白藜蘆醇前,100個菌株中多黏菌素B的MIC值≥4 μg/mL有90 個菌株,其他10 個菌株為2 μg/mL。加入白藜蘆醇后,分離株中針對多黏菌素B的MIC顯著降低。在CRE,CRPA,CRAB三類菌株中,白藜蘆醇均可發揮相似作用(見表1)。

表1 多黏菌素B單藥及聯合白藜蘆醇對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌的MIC值

2.3 多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯合對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌的FIC值

本研究選取了15 株菌株,結果發現15 株細菌菌株FIC指數均小于0.5,表明多黏菌素B和白藜蘆醇之間存在協同效應(見表2)。

表2 多黏菌素B與白藜蘆醇FIC指數

2.4 多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯合抑菌率分析

不同濃度多黏菌素B+128 μg/mL白藜蘆醇時,其抑菌率比單獨應用多黏菌素B有明顯升高(見圖1)。

圖1 多黏菌素B與白藜蘆醇單藥及聯合抑菌率分析

3 討 論

碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌是一類具有強大獲得性耐藥以及克隆、傳播能力的細菌,也是我國院內感染的重要病原菌之一[11-12]。近年來,隨著醫療技術的發展,抗生素藥物的廣泛應用,多重耐藥菌顯著上升,碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌的感染性和耐藥性也呈現上升趨勢,針對此類菌目治療是重癥感染患者救治的難點[13]。多黏菌素B是強效抗生素,在宿主防御微生物感染中發揮重要作用,并且是宿主免疫反應的關鍵效應物。多黏菌素B通過與細菌脂多糖的脂質體A結合,改變細胞膜結構,通透性增強[14-15]。有研究證實[16],多黏菌素B與其他抗生素聯合可提高藥物抗菌活性,但目前尚未對此聯合用藥方案作出統一規定。白藜蘆醇是一種天然抗自由基、抗氧化劑,最早從葫蘆中分離出來,能夠阻止低密度脂蛋白氧化,可防治心血管疾病如高脂血癥、動脈粥樣硬化等[17]。有學者表示[18],白藜蘆醇有一定抗菌作用,且作為天然化合物,聯合用藥安全性更有保障。本研究以上述理論為基礎,探討了多黏菌素B與白藜蘆醇聯合在碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌中的應用價值。

研究選取了100 株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌,包括CRE 38 株、CRPA 22 株、CRAB 40 株。通過監測多黏菌素B單藥與白藜蘆醇聯合對CRE,CRPA,CRAB抗菌效果可知,各菌株對白藜蘆醇的MIC值均在512 μg/mL以上,加入白藜蘆醇前,100 個菌株中多黏菌素B的MIC值≥4 μg/mL有90個菌株,其他10 個菌株為2 μg/mL。加入白藜蘆醇后,分離株中針對多黏菌素B的MIC顯著降低,且在CRE,CRPA,CRAB三類菌株中,白藜蘆醇均可發揮相似作用。MIC值是藥物活性指標,上述結果說明與單獨應用多黏菌素B相比,添加白藜蘆醇能夠在某種程度上增加多黏菌素B的藥物活性,且對3 種菌株均有效果,說明白藜蘆醇發揮的協同作用普適性較好[19-20]。通過棋盤試驗可知,15 株細菌菌株FIC指數均小于0.5,表明多黏菌素B和白藜蘆醇之間存在協同效應。在探討不同濃度多黏菌素B+128 μg/mL白藜蘆醇時,藥物抑菌率明顯提升。