miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群在原發性肝癌早期診斷及預后評估中的應用價值*

魯建鋒 蔡 瑩 徐佳靈

杭州市蕭山區第一人民醫院 1.感染科 2.呼吸內科 3.腫瘤內科 (浙江 杭州, 311201)

原發性肝癌(PHC)早期癥狀不典型,診斷難度較大,臨床超過80%的PHC患者確診時即已為中晚期,影響患者生活與預后質量[1]。因此,探尋更加簡便、科學、準確的分子標志物以提高PHC的早期篩查診斷準確率是臨床研究的熱點。微小核糖核酸-934(miR-934)是近年來研究較多的非編碼RNA小分子,在人體內廣泛分布,有研究指出miR-934在腫瘤發生與發展中發揮了重要作用[2,3]。泛素結合酶UbcH10(UbcH10)是一種具有細胞周期調節作用的蛋白,能夠影響有絲分裂的后期轉換從而參與腫瘤的發生與進展過程[4,5]。免疫功能異常引起的腫瘤細胞免疫逃逸與肝癌的發生之間關系密切,其中T淋巴細胞亞群(包括CD3+、CD4+、CD8+等)對人體腫瘤細胞的清除發揮著關鍵作用。近期研究指出腫瘤免疫逃逸機制與T細胞有關[6,7],在惡性腫瘤的診斷、治療與病情評估中具有較高價值。本研究探討miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群在PHC早期診斷及預后評估中的應用價值,現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2019年1月至2022年1月我院200例肝部腫瘤患者臨床資料,根據患者穿刺活檢或手術病理檢查結果,肝良性腫瘤患者106例(良性組),肝惡性腫瘤患者94例(PHC組)。納入標準:①因肝區不適、消化道癥狀或其他伴隨檢查發現未經定性的腫塊;②均接受miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群檢查;③經穿刺活檢或手術病理檢查最終定性;④臨床資料完整清晰;⑤患者對研究知情且自愿參與。排除標準:①合并嚴重腹部創傷或維生素K缺乏癥;②繼發性肝腫瘤;③合并消化道活動性感染;④合并嚴重精神疾病或認知障礙;⑤合并免疫功能缺陷病。本研究經蕭山區第一人民醫院醫學倫理委員會批準,倫理審批號:[2018]倫審批第002號。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-934檢測 采集患者外周空腹靜脈血樣5 ml,以15 cm半徑、3 500轉/min離心15 min后取上清液,-20℃低溫保存備用;采用實時熒光定量PCR 法檢測miR-934表達情況,使用總RNA提取試劑盒(北京盒子生工科技有限公司)提取總RNA,使用逆轉錄試劑盒(美國賽默飛世爾公司)逆轉錄得到cDNA,以 cDNA為模板進行實時熒光定量PCR 法檢測,5 min 94℃、30 s 94℃、35 s 60℃、20 s 72℃反應條件下40個循環,引物由武漢賽培生物科技有限公司合成(miR-934 5′-3′:UGUCUACUACUGGAGACACUGG),采用2-ΔΔCt法計算血清miR-934相對表達量。

1.2.2 腫瘤組織UbcH10檢測 所有患者術中或穿刺活檢過程中均采集肝腫瘤組織樣本一小塊,將RNA抽提劑(北京盒子生工科技有限公司)加入100 mg腫瘤組織樣本內提取總RNA,使用超微量紫外分光光度計(瑞士METTLER TOLEDO公司,UV5Nano)檢測RNA純度,使用逆轉錄試劑盒(美國賽默飛世爾公司)逆轉錄得到cDNA,以 cDNA為模板進行實時熒光定量PCR 法檢測,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,5 min 95℃、1 min 95℃、1 min 60℃、1 min 72℃反應條件下30個循環,UbcH10引物序列由武漢賽培生物科技有限公司設計合成(內參GAPDH 5′-3′:TTGGTATCGTGGAAGGAGTCA;UbcH10 5′-3′:GATAGCAGGGCGTGAGGAAC),采用2-ΔΔCt法計算腫瘤組織的UbcH10相對表達量。

1.2.3 外周血CD3+、CD4+、CD8+檢測 采集患者外周空腹靜脈血樣5 ml,加入2 ml 乙二胺四乙酸(EDTA)混合均勻,吸取10 μl白細胞分化抗原檢測試劑(CD3+、CD4+、CD8+,美國賽默飛世爾公司)與100 μl全血混合均勻,37℃避光孵育15 min,然后分別加入溶血素2 ml后重復孵育1次,使用鞘液5 min 1 500轉/min清洗2次,重懸細胞后使用流式細胞儀(美國BD Biosciences,FACSCanto Ⅱ)檢測CD3+、CD4+、CD8+表達水平。

1.3 觀察指標 比較PHC與肝良性腫瘤患者的miR-934、UbcH10、CD3+、CD4+、CD8+表達情況。參考《PHC診療規范(2017年版)》標準[8]將PHC分為Ⅰ～Ⅳ期,比較不同分期PHC患者的miR-934、UbcH10、CD3+、CD4+、CD8+表達情況。以穿刺活檢或手術病理檢查為金標準,分析miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞檢測與miR-934+UbcH10+外周血T淋巴細胞亞群聯合檢測診斷PHC的靈敏度、特異度,建立接受者操作特征(ROC)曲線,分析miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群診斷PHC的效能。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件分析數據,年齡、腫塊直徑、體質指數、miR-934、UbcH10、CD3+、CD4+、CD8+采用t或F檢驗,性別、特異度、靈敏度、符合率采用χ2檢驗,miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞診斷PHC的效能采用ROC曲線分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較 見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群表達情況比較 見表2。

表2 兩組患者miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群表達情況比較

2.3 不同臨床分期PHC患者miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群表達情況比較 PHCⅠ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期患者的miR-934、UbcH10、CD3+、CD4+、CD8+差異有統計學意義(P<0.05)。PHCⅢ～Ⅳ期患者的miR-934、UbcH10高于PHCⅠ期、Ⅱ期患者,CD3+、CD4+、CD8+低于PHCⅠ期、Ⅱ期患者(P<0.05);PHCⅡ期患者的miR-934、UbcH10高于PHCⅠ期患者,CD3+、CD4+、CD8+低于PHCⅠ期患者(P<0.05),見表3。

2.4 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群診斷PHC的結果 miR-934≥30.00(相對表達量2-ΔΔCt表示)視為惡性,反之為良性;UbcH10≥0.30(相對表達量2-ΔΔCt表示)視為惡性,反之為良性;T淋巴細胞亞群中CD3+≤67.00(%)、CD4+≤35.00(%)、CD8+≤24.00(%)視為惡性,反之為良性。miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞診斷PHC的結果見表4。

表4 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群診斷PHC的結果 (例)

2.5 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群診斷PHC的效能 見表5。miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群診斷PHC的ROC曲線見圖1。

圖1 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞診斷PHC的ROC曲線

表5 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群診斷PHC的效能

3 討論

PHC早期癥狀不典型且無特異性,隨著腫瘤生長患者可逐漸出現腹部不適、無故性腹瀉、肝區疼痛等癥狀,易與肝良性腫瘤混淆,漏診誤診率較高,具有診斷難度大、臨床處理棘手、患者預后差、病死率高等特點。隨著我國肝癌防控防治工作的總體進展,近10年來肝癌得到了有效控制,肝癌發病率總體趨于穩定[9]。但由于人口基數較大,因此目前我國現存肝癌患者人數仍然比較多。2020年全球最新癌癥負擔數據[10]顯示,我國2020肝癌新發人數位居惡性腫瘤第5位,超過了41萬人,總體保持較為穩定的發病趨勢,但2020年肝癌致死人數卻超過了39萬人,與新發人數接近,這提示我國肝癌患者死亡率仍處于較高水平。PHC的早期診斷與病情評估能夠幫助臨床優化治療方案,從而控制腫瘤進展速度,減輕患者治療負擔,提高患者生存與預后質量。隨著腫瘤病理機制研究的發展與進步,越來越多的分子標志物被應用于肝癌的診治之中,其中外周血T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+等)、miR-934、UbcH10等分子標志物均與PHC的發生和發展有關,對于PHC的早期篩查、診斷、治療具有重要意義。但目前臨床關于miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群在PHC診治中的研究多集中于單一指標,關于三者聯合檢測診斷PHC的研究少見。因此本研究探討miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群診斷PHC的價值及對患者預后的影響,旨在為PHC診療提供參考。

本研究結果顯示,PHC患者的血清miR-934與腫瘤組織UbcH10水平高于肝良性腫瘤患者,外周血T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)低于肝良性腫瘤患者,表明良惡性肝腫瘤患者的miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群表達水平具有顯著差異,可為PHC的鑒別診斷提供參考。結果還顯示,PHCⅢ～Ⅳ期患者的miR-934、UbcH10高于PHCⅠ期、Ⅱ期患者,CD3+、CD4+、CD8+低于PHCⅠ期、Ⅱ期患者,表明miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群表達與PHC臨床分期存在關聯,臨床分期越高、預后越差的PHC患者miR-934等指標異常高/低表達越明顯。診斷結果顯示,miR-934+UbcH10+外周血T淋巴細胞亞群聯合診斷PHC的符合率、靈敏度、陽性預測值、陰性預測值分別為89.50%、90.43%、87.63%、91.26%,均高于miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群單獨診斷,表明miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群聯合檢測能夠提高PHC診斷準確率,為肝腫瘤的篩查、鑒別診斷以及治療提供更科學的參考依據。可能的影響機制有:① 泛素-蛋白酶體系統是機體蛋白質降解的主要途徑,泛素-蛋白酶體系統功能異常通常會導致疾病,臨床研究證實神經退行性疾病、心血管疾病、惡性腫瘤的發生發展與泛素-蛋白酶體系統功能異常間存在密切關聯[11,12]。UbcH10在腫瘤發生和發展中發揮了重要作用,是泛素結合酶E2家族成員,其參與了泛素介導的蛋白質降解途徑,對細胞進展(包括腫瘤細胞與正常細胞)調控和蛋白質動態平衡均發揮了重要調節作用,UbcH10高表達會導致細胞周期蛋白降解異常,導致細胞染色體組的穩定性降低,從而增加腫瘤發生與進展風險[13]。② miR-934是近年研究較多的RNA小分子,2020年《Journal Of Hematology &Oncology》發布了一項關于miR-934對癌癥影響的研究成果[14],該研究證實miR-934具有誘導巨噬細胞M2極化,從而促進結直腸癌向肝部轉移的作用,其中miR-934介導的巨噬細胞M2極化作用可能在PHC的發生與發展中也發揮了重要影響作用,miR-934表達升高能夠增加肝癌細胞的侵襲與轉移能力。③金方方等[15]的研究證實微環境機體免疫狀態與肝癌發生和發展存在關聯;T淋巴細胞亞群是人體內重要的免疫相關細胞,CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞能夠促進細胞毒性T淋巴細胞的形成,實現抗病毒與抗腫瘤作用,而T 淋巴細胞功能受損會導致外周血CD3+、CD4+、CD8+表達下降,增加腫瘤細胞免疫逃逸機會,增加PHC發生風險,加快病情進展速度[16]。

綜上所述,miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群與PHC發生、發展、預后關系密切,通過miR-934、UbcH10、外周血T淋巴細胞亞群聯合檢測能夠提高PHC診斷準確率,評估PHC患者病情及預后質量,具有臨床應用價值。