大黃總蒽醌抑制肝纖維化的作用與機制*

江 慧 陳 晶 曾 超

宿遷市第一人民醫(yī)院藥學部 (江蘇 宿遷, 223800)

肝纖維化是肝炎向肝硬化發(fā)展的重要階段[1]。在肝硬化發(fā)展的過程中,肝功能損害逐漸加重,血清層黏蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)等纖維化指標均升高[2]。此外,該過程中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、MAPK/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路也有關(guān)鍵作用[3]。有研究指出,調(diào)控TGF-β1/MAPK、MAPK/ERK通路通過抑制TGF-β1表達,下調(diào)MAPK和ERK的磷酸化水平有助于抗肝纖維化[4,5]。目前臨床上仍缺乏高效的抗肝纖維化的藥物。大黃總蒽醌是大黃的主要成分,大黃具有保肝利膽的功效,且有研究證實大黃總蒽醌對免疫性肝纖維化大鼠具有肝保護作用[6],但是大黃總蒽醌是否能夠調(diào)控上述信號通路發(fā)揮抗肝纖維化作用仍需要深入探討。故此,本研究取60只成年SD大鼠開展動物實驗,以期為臨床患者肝纖維化和肝硬化的防治研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 動物 60只成年SD大鼠,SPF級,雌雄各半,6～8周齡,200～220 g,均購自河南省實驗動物中心,合格證號:SCXK(豫)2018-0007。

1.2 藥物 大黃總蒽醌干粉(南京普怡生物科技有限公司,純度≥98%,其中大黃素∶大黃酸∶大黃酚∶蘆薈大黃素占比為6∶9∶7∶7,符合《中國藥典》質(zhì)控標準[7]);秋水仙堿(上海吉至生化科技有限公司,純度≥98%)。

1.3 試劑及儀器 鼠血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、LN、HA和IV-C酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司,批號:1802003、1806013、1804025、1805036、1803017);二甲苯溶液、乙醇、鹽酸酒精(上海恪敏生物科技有限公司,貨號:H2503、H2248、H3067);蘇木精-伊紅染色法(HE)和Masson染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,批號:20180401、20180936);Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司,批號:R18041052);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司,批號:R18060193);ddH2O、2×qPCR Mix(武漢博士德生物工程研究所,貨號:A181036、A180714);蛋白定量試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司,批號:R20180506);兔抗鼠TGF-β1、p38MAPK、ERK1/2、P-p38MAPK、P-ERK1/2單克隆抗體(一抗),辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔TGF-β1、p38MAPK、ERK1/2、P-p38MAPK、P-ERK1/2多克隆抗體(二抗)(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,批號:1801106、1802140、1803175、1803112、1806107、1802214、1803149、1804101、1805127、1807135);電化學發(fā)光(ECL)試劑(瑞士羅氏公司,貨號:E181203)。

FA1204B 型電子天平(上海精密科學儀器有限公司);Varioskan LUX型酶標儀(美國Thermo公司);Allegra X-15R型臺式離心機(美國Beckman Coulter公司);EG1150H+C型石蠟包埋機(德國Leica公司);RM2255型組織切片機(德國Leica公司);CKX31型光學顯微鏡(日本Olympus公司);2720型聚合酶鏈反應(yīng)擴增儀(美國ABI公司);TE70XP型轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司);JY04S-3E型凝膠分析系統(tǒng)(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)。

1.4 造模方法 所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。除正常對照組外,其余各組均采用四氯化碳、乙醇誘導肝纖維化。造模方法:取10 ml/kg酒精混合物(乙醇∶吡唑∶玉米油=10 ml∶25 mg∶2 ml)灌服,每天1次;同時每周2次腹腔注射四氯化碳橄欖油混合液(四氯化碳∶橄欖油=1∶3),每次劑量0.3 mg/kg,連續(xù)造模2個月后參照文獻方法[8]鑒定造模是否成功。

1.5 干預方法 確定造模成功后,低、中、高劑量組分別給予大黃總蒽醌干粉0.3、0.6、1.2 g/kg溶于0.01 ml/g大鼠體質(zhì)量生理鹽水中灌胃,陽性藥組給予秋水仙堿1 mg/kg溶于0.01 ml/g大鼠體質(zhì)量生理鹽水中灌胃,正常對照組和模型對照組均給予0.01 ml/g大鼠體質(zhì)量生理鹽水灌胃,每天1次,共8周。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 觀察干預期間大鼠一般情況 包括毛發(fā)色澤、二便、體質(zhì)量變化等,其中體質(zhì)量采用電子天平檢測。

1.6.2 肝功能及肝纖維化指標檢測 分別于給藥前、4周后、8周后對大鼠經(jīng)尾靜脈采取血液標本,5 ml/只。以2 500 r/min轉(zhuǎn)速對待檢測標本以臺式離心機離心5 min,對上清液分離后采用酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒對血清AST、ALT、LN、HA和IV-C水平進行定量測定,用雙對數(shù)線性回歸曲線擬合方式繪制標準曲線,以空白調(diào)零,采用酶標儀測定450 nm波長處各孔OD值。

1.6.3 肝組織病理學變化 以HE染色觀察。將大鼠處死后迅速剝離肝臟,取肝組織常規(guī)固定處理,包埋后梯度濃度乙醇水化,切片、烤片、脫蠟,梯度濃度乙醇脫苯,蘇木精染色5～10 min,沖洗后以鹽酸乙醇分化處理,并以伊紅復染,脫水、透明、封片、封固。另外采用Masson染色試劑盒進行處理,以光學顯微鏡觀察肝組織病理學變化。計算大鼠肝臟指數(shù),即肝臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值;參照文獻[9]對大鼠肝纖維化進行分級,將無纖維化記為0級;將匯管區(qū)擴大纖維化、局限竇周及小葉內(nèi)纖維化記為1級;將匯管區(qū)周圍纖維化、纖維間隔形成,小葉結(jié)構(gòu)保留記為2級;將大量纖維間隔形成伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂但無肝硬化記為3級;將有早期肝硬化記為4級。

1.6.4 肝組織TGF-β1、p38MAPK、ERK1/2、ERK2 mRNA表達檢測 取肝組織研磨后勻漿,以試劑盒提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄,對互補的DNA鏈進行qRT-PCR方法檢測。PCR擴增反應(yīng)體系共25 μl,其中ddH2O、 2×qPCR Mix、7.5 μm引物+互補的DNA,分別為8、12.5、2、2.5 μl。TGF-β1上游引物序列:5′-ATCGCTAGAGAGGATCGGAGACTAG-3′,下游引物序列:5′-TGCGTATAGGCGCGATAGGCTAGAC-3′;p38MAPK上游引物序列:5′-AGCTCGAGAGGCTCTAGAGCTAGC-3′,下游引物序列:5′-TCGATAGCTATAGGGCTAGAGCTA-3′;ERK1/2:上游引物序列:5′-ATGCGCTAGAGAGCTAGAGCTAG-3′,下游引物序列:5′-CTGGGGGATAGGGCGGCTAGAGCTAG-3′;ERK2上游引物序列:5′-ATGGCTCGGCGTTTAGAGGCGCGATGC-3′,下游引物序列:5′-TGGAGAGCTATATATTCTGCGATGCTA-3′;β-actin(內(nèi)參)上游引物序列:5′-TGGTTTCGCGATATGGC-GCGATAG-3′,下游引物序列:5′-ATGCTCTAGAGGAGCTA-GAGAGC-3′,上述引物均委托深圳晶美生物科技工程有限公司設(shè)計并合成,預計擴增產(chǎn)物長度分別為:346 bp、320 bp、282 bp、268 bp、240 bp。PCR擴增反應(yīng)條件:92℃(30 s),45個循環(huán):95℃(60 s)、60℃(40 s)、55℃(120 s),最后50℃(10 min)。繪制熔解曲線,2-ΔΔCT即為目的基因的表達量。

1.6.5 肝組織TGF-β1、p38MAPK、ERK1/2、ERK2、P-p38MAPK、P-ERK1/2、P-ERK2蛋白表達檢測 以Western Blotting法檢測。取肝組織勻漿后12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,取蛋白并BCA定量。取50 μg樣本并加入凝膠,電泳后轉(zhuǎn)膜、過夜。加入一抗,4℃過夜;加入二抗,室溫2 h。實施ECL反應(yīng),曝光并顯色,以GAPDH為內(nèi)參,以目的蛋白與內(nèi)參條帶光密度的比值記為目的蛋白的相對表達量,并計算P-p38MAPK/p38MAPK、P-ERK1/2/2/ERK1/2/2、P-ERK2/ERK2。

2 結(jié)果

正常對照組、模型對照組、陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組在實驗過程中分別有0、2、1、2、1、1只大鼠死亡,死因主要為灌胃誤入肺內(nèi)、肺部感染、灌胃操作失誤誤傷脊髓等,各組分別有10、8、9、8、9、9只大鼠存活。

2.1 各組大鼠一般情況 正常對照組干預期間飲食、二便正常,體質(zhì)量穩(wěn)定,毛發(fā)有光澤且濃密;模型對照組干預期間食欲不佳,大小便頻率減少,大小便性狀基本正常,體質(zhì)量下降,毛發(fā)暗且稀疏;低劑量組干預期間食欲下降,大小便頻率減少且性狀基本正常,體質(zhì)量有所下降,毛發(fā)暗且稀疏;中劑量組和陽性藥組干預期間食欲尚可,大小便頻率及性狀基本正常,體質(zhì)量有輕微下降,毛發(fā)暗;高劑量組干預期間食欲良好,二便性狀正常,大便頻率有所增多,體質(zhì)量基本穩(wěn)定,毛發(fā)有光澤且濃密。

2.2 各組大鼠肝功能指標變化比較 見表1。

表1 各組大鼠肝功能指標變化比較

2.3 各組大鼠肝纖維化指標變化比較 見表2。

表2 各組大鼠肝纖維化指標變化比較

2.4 各組大鼠肝組織病理學變化觀察 圖1和圖2示,與正常對照組大鼠比較,模型對照組大鼠肝細胞內(nèi)可見大量空泡,細胞核皺縮甚或消失,匯管區(qū)有大量炎性浸潤,可見嚴重纖維化病變;與模型對照組比較,陽性藥組和3劑量組脂肪變性、空泡、細胞核皺縮、肝小葉受損、匯管區(qū)炎性浸潤和纖維化病變程度均減輕;與陽性藥組比較,低劑量組上述病理學變化均加重,中劑量組均無明顯變化,高劑量組上述病理學變化均減輕。

圖1 各組大鼠肝組織病理學變化觀察(HE染色,×100)

圖2 各組大鼠肝組織病理學變化觀察(Masson染色,×100)

2.5 各組大鼠肝臟指數(shù)和肝纖維化分級 見表3。

表3 各組大鼠肝臟指數(shù)和肝纖維化分級比較

2.6 各組大鼠肝組織TGF-β1、p38MAPK、ERK1/2、ERK2 mRNA表達比較 見表4。

表4 各組大鼠肝組織TGF-β1、p38MAPK、ERK1/2、ERK2 mRNA表達比較

2.7 各組大鼠肝組織TGF-β1、p38MAPK、ERK1/2、ERK2、P-p38MAPK、P-ERK1/2、P-ERK2蛋白表達比較 見表5和圖3、4。

圖3 各組大鼠肝組織TGF-β1、p38MAPK蛋白及P-p38MAPK 水平檢測(Western Blotting檢測)

圖4 各組大鼠肝組織ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表達 檢測(Western Blotting檢測)

表5 各組大鼠肝組織TGF-β1、p38MAPK、ERK1/2、P-p38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達比較

3 討論

肝纖維化是指病毒、自身免疫因素、乙醇、藥物、膽汁淤積、代謝紊亂等原因所致的肝臟炎性損傷隨著時間的推移而發(fā)展,引發(fā)的以肌成纖維細胞被激活、細胞外基質(zhì)大量合成和分泌為主要特點的病理過程[10]。研究認為,在肝纖維化發(fā)展的過程中,細胞外基質(zhì)大量沉積于肝小葉內(nèi)和匯管區(qū),可造成局部組織變性壞死,甚至可進展為肝硬化[11]。但是目前常用的方法對肝纖維化發(fā)展的防治作用效果均不甚理想,仍需積極探討合理有效的方案。

本次研究中,治療后陽性藥組和低、中、高劑量組狀態(tài)較模型對照組好轉(zhuǎn),且血清AST、ALT、LN、HA、IV-C水平均較治療前下降,且高劑量組治療8周后上述指標水平與治療前基本保持不變,可知秋水仙堿、大黃總蒽醌可促進大鼠的狀態(tài)好轉(zhuǎn),并且還可保護大鼠的肝功能,抑制肝纖維化;模型對照組肝細胞內(nèi)可見大量空泡,細胞核皺縮甚或消失,匯管區(qū)有大量炎性浸潤,可見嚴重纖維化病變,陽性藥組和高、中、低劑量組病理學改變則有所減輕,且高劑量組的肝臟組織病理學觀察結(jié)果與正常對照組最為接近,肝臟指數(shù)和肝纖維化分級結(jié)果顯示高劑量組優(yōu)于低劑量組、中劑量組和陽性藥組,可知秋水仙堿、大黃總蒽醌均可減輕大鼠的病情,控制肝纖維化,且大黃總蒽醌的作用呈明顯的劑量依賴性。秋水仙堿是從秋水仙中提取的生物堿,可抗炎、抑制肝纖維化和肝硬化,在臨床中其作用已得到肯定[12],故本研究選用該藥物作為陽性對照,且本研究所用秋水仙堿的劑量為臨床等效劑量。大黃可保肝利膽,在既往的研究中表明大黃可促進肝細胞再生,刺激產(chǎn)生干擾素抑制病毒繁殖,還可促進肝臟血液循環(huán)改善局部微循環(huán),并且還能疏通肝內(nèi)毛細膽管減輕膽汁淤積,因而保肝作用顯著[13]。大黃總蒽醌為大黃的有效成分,該藥物有助于減輕自身免疫性肝纖維化大鼠的病情程度,且還可顯著控制細胞外基質(zhì)的合成和分泌,增加細胞外基質(zhì)的降解,通過上述途徑減少肝細胞外基質(zhì)的沉積,從而有助于減輕肝纖維化。覃魯珊等[14]研究顯示大黃蒽醌與鞣質(zhì)對大鼠肝臟具有損傷和保護雙向作用,且大黃蒽醌類成分對肝臟的保護作用強于大黃鞣質(zhì)類成分,本研究結(jié)果與上述報道部分結(jié)果相符,但本研究并未發(fā)現(xiàn)大黃總蒽醌對實驗動物有肝損傷作用,可能由于本研究中大黃總蒽醌低、中、高劑劑量組的給藥劑量遠低于上述報道,也提示將大黃總蒽醌應(yīng)用于臨床中時應(yīng)嚴格注意使用劑量,確保安全。

TGF-β1是公認的與肝纖維化發(fā)展密切相關(guān)的因子之一[15-17],其基因與蛋白表達被激活可促使肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化,并且還可誘導合成大量的細胞外基質(zhì),與肝纖維化指標、肝纖維化嚴重程度均密切相關(guān)。MAPK受TGF-β1的調(diào)控,有研究認為,在肝纖維化發(fā)展過程中P-p38MAPK水平異常升高,可介導細胞核引起一系列的生物學反應(yīng),影響肝細胞的增殖和活化過程,誘導肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展;ERK包含ERK1和ERK2,受MAPK調(diào)控,與肝細胞的增殖活化密切相關(guān)[18]。研究顯示,磷酸化的ERK1/2可進入細胞核內(nèi),對轉(zhuǎn)錄因子及細胞周期蛋白D的表達發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,促使細胞增殖,且與肝小葉內(nèi)、匯管區(qū)纖維化變性也有緊密關(guān)聯(lián)[19]。另有報道指出,夏枯草總?cè)瓶赏ㄟ^阻斷ERK信號通路,控制ERK1/2的磷酸化水平抑制肝纖維化的發(fā)展,發(fā)揮抗肝纖維化作用[20]。本研究中,與正常對照組比較,模型對照組TGF-β1 mRNA及蛋白表達,P-p38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達均顯著升高,而與模型對照組比較,陽性藥組和低、中、高劑劑量組上述水平均顯著下降,且與陽性藥組比較,低劑量組均顯著升高,中劑量組均基本未變,高劑量組均顯著下降,表明大黃總蒽醌可調(diào)控大鼠模型肝組織TGF-β1-MAPK/ERK通路。結(jié)合上述分析報道及本研究結(jié)果,推測大黃總蒽醌很可能是通過調(diào)控大鼠模型肝組織TGF-β1-MAPK/ERK通路抑制TGF-β1 mRNA及蛋白表達,降低P-p38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達進而實現(xiàn)改善肝功能、降低血清肝纖維化指標水平、減輕肝纖維化病變的作用的。

綜上,大黃總蒽醌可改善大鼠的一般狀態(tài)、保護肝功能,還可降低血清肝纖維化指標水平,減輕肝臟組織病變程度,且中劑量的大黃總蒽醌作用與秋水仙堿相近,而高劑量的大黃總蒽醌作用最佳。推測大黃總蒽醌很可能是通過調(diào)控大鼠肝組織TGF-β1-MAPK/ERK通路抑制TGF-β1 mRNA及蛋白表達,降低P-p38MAPK、P-ERK1/2蛋白表達發(fā)揮上述作用的。但大黃總蒽醌是否通過調(diào)控此路徑發(fā)揮抗肝纖維化作用的仍需要進一步研究證實。