大黃酸通過Sirt1/AMPK信號通路對非酒精性脂肪性肝病小鼠肝功能及肝細胞脂代謝的影響*

王希文 賀 瓊 杜 凡 胡 維

1.武漢市紅十字會醫(yī)院藥劑科 (湖北 武漢, 430000) 2.武漢市紅十字會醫(yī)院消化內(nèi)科 3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)影響全球約四分之一的成年人,是目前世界范圍內(nèi)最流行的慢性肝病之一[1]。然而,NAFLD發(fā)病機制尚不清楚,目前除了改變生活方式以減輕體重和增加體育活動外,沒有其他治療NAFLD的方法被批準[2]。因此,迫切需要探求NAFLD的有效治療方法。大黃酸是中藥大黃、首烏、虎杖等的主要活性成分之一,屬蒽醌類衍生物,具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、降糖、調(diào)脂、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3,4]。研究證實大黃酸對大鼠和小鼠的NAFLD均具有治療作用[5,6]。另外,大黃酸通過抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝紊亂來防治NAFLD[7],但目前關(guān)于大黃酸對NAFLD的保護機制研究仍極少報道。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(Sirt1)/amp活化蛋白激酶(AMPK)信號通路的激活有助于改善NAFLD的脂質(zhì)積累和炎癥[8]。此外,Sirt1被證明可以調(diào)節(jié)NAFLD中AMPK的激活,從而增強脂肪分解和β氧化,并改善肝臟脂肪過多[9,10]。為進一步明確大黃酸治療NAFLD的治療效果及其作用機制[11],本課題組在體內(nèi)動物模型中研究證實了大黃酸對NAFLD小鼠的肝功能改善效果及對小鼠肝細胞脂代謝的影響,并在體內(nèi)外模型中初步研究了大黃酸改善肝功能及脂代謝的分子機制,為其進一步的臨床推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康ICR小鼠,雄性,4周齡,購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,動物合格證號:SCXK(湘)2011-0003,均符合《實驗動物管理條例》要求,并常規(guī)飼養(yǎng)待其完全適應(yīng)新環(huán)境后進行實驗研究。

1.2 儀器 ES-100E電子天平(長沙湘平科技有限公司);YXQ-LS-SⅡ型立式蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SW-CJ-1D型凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);Allegra X-22R型多功能臺式冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司);全自動生化檢測一體機(瑞士Roche cobas8000);Meta-Morph圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司);VICTOR X5型酶標儀(美國Perkin Elmer公司)等。

1.3 藥品與試劑 大黃酸購于武漢欣申試化工科技有限公司(批號R111266),使用前取2 g大黃酸,將其溶于200 ml的0.9%氯化鈉溶液,制成1%大黃酸混懸液;普通動物飼料(批號SPS9112)及高脂飼料(60%脂肪、20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì),批號XTHF60)購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT,批號BYX-002393-K)ELISA試劑盒購自常州貝源鑫生物科技有限公司;天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST,批號69-21213)、乙酰輔酶羧化酶(ACC,批號69-21202)、ELISA試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司,油紅O染色試劑盒(批號C0157S,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);棕櫚酸(PA)購自上海吉至生化科技有限公司(批號P63761);兔抗鼠Sirt1、amp活化蛋白激酶α(AMPKα)、磷酸化AMPKα(p-AMPKα)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自abcam公司(批號ab110304、ab32047、ab131357、ab8245)等。

1.4 NAFLD小鼠模型構(gòu)建、分組及處理 將健康雄性ICR小鼠50只用于建模,標記并稱重記錄;以連續(xù)飼喂高脂飼料(8周)構(gòu)建NAFLD小鼠模型,符合建模標準39只。建模成功判定依據(jù)為:肝細胞腫大變圓,可見大量脂滴,胞質(zhì)疏松,肝細胞呈大泡型脂肪變性[12]。

將造模成功的36只小鼠隨機分為4組,即模型組、低劑量大黃酸組、高劑量大黃酸組、高劑量大黃酸+EX527組,每組9只,另選擇9只正常喂養(yǎng)的健康雄性ICR小鼠作為空白組。低、高劑量大黃酸組分別采用100、250 mg/kg大黃酸灌胃處理,其劑量依據(jù)參考文獻和前期預(yù)實驗確定;高劑量大黃酸+EX527組采用250 mg/kg大黃酸灌胃的同時腹腔注射10 mg/kg Sirt1抑制劑EX527[13],每天1次,連續(xù)8周;空白組和模型組給予等量0.9%生理鹽水灌胃處理。各組小鼠自由進食進水,每周稱重1次。8周干預(yù)完成后各組小鼠于大體實驗前稱重并記錄。

1.5 NAFLD小鼠血清血脂、肝功能指標及氧化應(yīng)激指標水平檢測 干預(yù)8周后,小鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(按每100 g體重注射0.14 ml),開腹,經(jīng)下腔靜脈采血2 ml,1 500轉(zhuǎn)/min離心10 min取血清,用生理鹽水稀釋用于檢測。其中全自動生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、游離脂肪酸(NEFA),ELISA檢測ALT、AST,得出觀測值水平,乘以稀釋倍數(shù)換算作為實際水平。

1.6 ELISA法檢測NAFLD小鼠肝臟組織脂代謝指標含量 小鼠經(jīng)1.5處理后,游離肝臟并去除包膜,取出完整肝臟并稱濕重;采集小塊肝左葉組織,組織勻漿,經(jīng)12 000轉(zhuǎn)/min 4℃離心10 min取上清液,ELISA法檢測肝臟組織ACC含量。

1.7 油紅O、HE染色法檢測小鼠肝臟病理變化 小鼠經(jīng)1.5處理后,用巴氏吸管向肝組織表面緩慢滴加肝素生理鹽水溶液(12 500 U肝素鈉與100 ml生理鹽水配比),待肝臟表面變白后投入4%多聚甲醛固定液,4℃冷藏18 h繼續(xù)15%、40%沉糖脫水,最后OCT常規(guī)包埋行15 μm厚冰凍切片,彎頭鑷子小心攤開直接裱在防脫載玻片上。每組若干白片分別經(jīng)油紅O、HE染色后制片,最后掃描切片分析各組小鼠肝組織病理變化。

1.8 細胞培養(yǎng)及存活率檢測 小鼠永生化AML-12肝細胞系購于中國科學(xué)院上海細胞培養(yǎng)庫。將AML-12細胞培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素、0.1 mol/L地塞米松和1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中。用含大黃酸(0、2、4、8、16、32 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基處理AML-12細胞24 h,以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)中的大黃酸作為對照。處理后,去除含大黃酸的無血清培養(yǎng)基,加入新鮮培養(yǎng)基;然后孵育4 h使細胞穩(wěn)定。最后,分別加入MTT溶液(5 g/L)10 μl,4 h后去除培養(yǎng)基,將活細胞中形成的不溶于水的甲瓚晶體溶解在100 μl DMSO中。使用酶標儀在490 nm處記錄吸光度。實驗重復(fù)3次,每次設(shè)置3個復(fù)孔。

1.9 NAFLD細胞模型構(gòu)建、分組和處理 為了建立NAFLD細胞模型,將PA溶于牛血清白蛋白中,然后將AML-12細胞置于200 μmol/L PA中24 h[8]。PA刺激的AML-12細胞隨機分為模型組,低、高劑量大黃酸組和高劑量大黃酸+EX527組,另選擇常規(guī)培養(yǎng)的AML-12細胞作為空白組。低、高劑量大黃酸組分別用終濃度2、4 μmol/L大黃酸(溶于0.1%二甲基亞砜,原液濃度20 mmol/L,并用無血清培養(yǎng)基稀釋成終濃度2、4 μmol/L的大黃酸)處理24 h,高劑量大黃酸+EX527組用4 μmol/L大黃酸和10 μmol/L EX527(溶于0.1%二甲基亞砜)[14]共處理24 h,模型組和空白組分別用等量的二甲基亞砜處理24 h。

1.10 細胞中TG含量檢測 各組AML-12細胞處理后制備細胞懸液,4℃離心(3 000轉(zhuǎn)/min)5 min后取上清液,采用全自動生化分析儀檢測TG含量。實驗重復(fù)3次,每次設(shè)置3個復(fù)孔。

1.11 油紅O染色觀察AML-12細胞脂質(zhì)積累情況 AML-12細胞接種至6孔板,按1.9的方法處理后,用多聚甲醛(4%)固定10 min,接著使用油紅O染色20 min,異丙醇(60%)和蒸餾水清洗后,在倒置熒光顯微鏡下觀察各組AML-12細胞的脂質(zhì)積累情況。實驗重復(fù)3次,每次設(shè)置3個復(fù)孔。

1.12 Western Blot檢測肝臟組織和AML-12細胞中Sirt1/AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達 使用RIPA緩沖液裂解各組AML-12細胞和1.6中每組9只小鼠的剩余部分肝臟組織。等量提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂乳在TBST中封閉膜,然后在4℃下與以下一抗孵育過夜:兔抗鼠Sirt1、AMPKα、p-AMPKα、GAPDH抗體。然后用辣根過氧化物酶結(jié)合的抗兔二抗孵育1 h,最后使用增強ECL試劑盒對印跡條帶進行可視化,使用Image J凝膠分析軟件分析條帶強度。細胞實驗重復(fù)3次,每次設(shè)置3個復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 各組AML-12細胞存活率比較 與0 μmol/L大黃酸相比,2、4、8 μmol/L大黃酸處理AML-12細胞24 h后細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),16、32 μmol/L大黃酸處理AML-12細胞24 h后細胞存活率顯著下降(P<0.05),故采用2、4 μmol/L的大黃酸作為低、高劑量組進行后續(xù)實驗。見圖1。

2.2 各組小鼠體重及肝臟濕重差異比較 見圖2、3。

圖2 各組小鼠體重差異比較 (n=9)

2.3 各組小鼠肝組織病理變化 空白組小鼠肝細胞呈正常形態(tài),炎性細胞浸潤少、細胞內(nèi)無明顯紅色脂滴積聚;模型組小鼠出現(xiàn)肝硬變,細胞腫脹變形,有大量炎性細胞浸潤,存在細胞壞死,紅色脂滴密度高且分布均勻;低劑量大黃酸組小鼠肝組織未發(fā)現(xiàn)明顯硬化壞死,腫脹減輕,但空泡化嚴重,脂滴密度高;高劑量大黃酸組小鼠肝細胞空泡化有所減輕,紅色脂滴密度顯著減少且較分散;與高劑量大黃酸組相比,高劑量大黃酸+EX527組小鼠肝組織炎性浸潤明顯,肝細胞空泡化嚴重,腫脹增加,脂滴密度升高。見圖4、5。各組大鼠NAFLD活動度積分和脂質(zhì)含量定量分析結(jié)果見圖6。

圖6 NAFLD活動度積分和脂質(zhì)含量定量分析

2.4 各組小鼠不同濃度灌胃處理后血脂、肝功能和肝臟組織脂代謝相關(guān)指標差異比較 與空白組小鼠相比,模型組小鼠血清TG、TC、MDA、ALT、AST和NEFA水平顯著升高,肝臟組織ACC含量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量大黃酸組小鼠血清TG、TC、MDA、ALT、AST和NEFA水平顯著下降,肝臟組織ACC含量顯著升高(P<0.05);與低劑量大黃酸組相比,高劑量大黃酸組小鼠血清TG、TC、MDA、ALT、AST和NEFA水平顯著降低,肝臟組織ACC含量顯著升高(P<0.05);與高劑量大黃酸組相比,高劑量大黃酸+EX527組小鼠血清TC、MDA、ALT、AST和NEFA水平顯著升高,肝臟組織ACC含量顯著降低(P<0.05)。見圖7。

圖7 各組小鼠不同濃度灌胃處理后肝功能和肝臟組織脂代謝相關(guān)指標比較(n=9)

2.5 各組小鼠不同濃度灌胃處理后肝臟組織Sirt1/AMPK通路蛋白表達比較 見圖8、9。

圖8 各組小鼠肝臟組織中Sirt1、AMPKα、p-AMPKα蛋白表達比較

圖9 各組小鼠不同濃度灌胃處理后肝臟組織Sirt1/AMPK通路蛋白表達比較(n=9)

2.6 各組AML-12細胞內(nèi)TG含量和脂質(zhì)積累水平比較 各組AML-12細胞內(nèi)TG含量見圖10。油紅O染色結(jié)果顯示,空白組無明顯的紅色脂滴聚集;模型組紅色脂滴呈均勻分布且密度高;低劑量大黃酸組紅色脂滴雖明顯減少,但密度較高;高劑量大黃酸組相比低劑量大黃酸組紅色脂滴減少且分散;高劑量大黃酸+EX527組相比高劑量大黃酸組的紅色脂滴增多且呈緊密分布。見圖11。

圖10 各組AML-12細胞TG含量比較(n=3)

圖11 各組AML-12細胞油紅O染色結(jié)果及定量分析(×200,n=3)

2.7 各組AML-12細胞內(nèi)Sirt1/AMPK通路蛋白表達比較 見圖12、13。

圖12 各組AML-12細胞中Sirt1、AMPKα、p-AMPKα蛋白表達比較

圖13 各組AML-12細胞內(nèi)Sirt1/AMPK通路蛋白表達差異比較(n=3)

3 討論

在全球范圍內(nèi),NAFLD的患病率迅速增加,NAFLD已成為慢性肝病的主要病因[15]。NAFLD除可直接導(dǎo)致失代償期肝硬化、肝細胞癌外,還可影響其他慢性肝病的進展,并參與2型糖尿病和動脈粥樣硬化的發(fā)病[16,17]。目前西醫(yī)尚無針對NAFLD的特效治療藥物,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究NAFLD逐漸深入的同時,越來越多的人將目光投向了中醫(yī)藥。中醫(yī)藥在NAFLD辨治用藥中有著明顯優(yōu)勢,突出體現(xiàn)在中藥治療能夠根據(jù)個人不同體質(zhì)及病因有針對性地進行治療,近年來越來越受到大眾的關(guān)注與認可[18]。

大黃酸具有減輕炎癥反應(yīng)、抗腫瘤、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種藥理活性,具備良好的生物活性,且使用起來較單味大黃熬汁取用更為安全,副作用也相對可控。研究表明大黃酸可降低HepG2細胞脂質(zhì)代謝[19],對高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠肥胖具治療作用[20],對NAFLD變性有明顯的改善作用[21]。然而,大黃酸對肝臟脂肪變性的有益作用機制尚未明確。本研究結(jié)果表明,低、高劑量的大黃酸均能降低TG、TC、MDA、ALT、AST、NEFA水平,升高ACC水平,體內(nèi)肝細胞脂質(zhì)積累得到明顯改善,尤其是高劑量大黃酸的改善效果更好,這與之前的研究一致[7],提示大黃酸特別是高劑量大黃酸對NAFLD小鼠脂質(zhì)代謝和肝臟損傷有明顯的改善作用。NEFA水平極易受脂代謝因素影響,而ACC則催化細胞中脂肪酸的從頭合成,二者對于脂代謝來說非常重要。研究顯示NAFLD模型中,NEFA水平增加、ACC水平降低[22],與本研究結(jié)果一致,說明大黃酸通過調(diào)節(jié)NEFA、ACC水平改善肝功能和脂代謝。另外,本研究通過細胞實驗發(fā)現(xiàn),低、高劑量大黃酸能夠明顯降低NAFLD細胞模型中的TG含量并抑制脂質(zhì)積累,且呈劑量依賴性,與Li等[8]的研究結(jié)果一致,提示大黃酸可改善細胞脂質(zhì)代謝,進而抑制NAFLD病程。

Sirt1是細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可改善組織胰島素敏感性并抑制肝脂肪變性的發(fā)生[23]。先前的一項研究表明,Sirt1的活性可以預(yù)防肝脂肪變性的發(fā)生,并且NAFLD患者的Sirt1表達低于健康個體[24]。AMPK的激活已被證明可以減少脂質(zhì)生成,增強脂肪酸氧化,最終抑制肝臟TG的積累和NAFLD的發(fā)展[25]。既往研究發(fā)現(xiàn),Sirt1可調(diào)控AMPK磷酸化水平,NAFLD小鼠中Sirt1和AMPK的表達被抑制,其表達上調(diào)可以預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性、肝臟炎癥和代謝紊亂[26]。在肝臟脂肪變性細胞模型中,Sirt1 mRNA/蛋白水平和AMPK磷酸化水平顯著降低[27]。以上研究均說明激活Sirt1/AMPK通路有利于改善肝臟脂肪代謝。然而,大黃酸是否通過激活該通路改善NAFLD進程尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),不同劑量大黃酸均能激活Sirt1/AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達,進而顯著改善體內(nèi)和體外肝細胞脂質(zhì)積累,其中高劑量的大黃酸治療效果更好,提示大黃酸對肝功能和脂代謝的改善作用可能與Sirt1/AMPK信號通路激活有關(guān)。進一步在高劑量大黃酸的基礎(chǔ)上給予Sirt1抑制劑EX527處理后,Sirt1和AMPK的表達明顯下降,說明EX527確實能抑制Sirt1/AMPK通路激活;同時,我們還發(fā)現(xiàn)EX527能夠部分恢復(fù)高劑量大黃酸對肝功能、脂代謝的影響,再次證實大黃酸通過激活Sirt1/AMPK信號通路減輕NAFLD小鼠肝功能損傷并改善肝細胞脂代謝。

另外,本研究HE染色結(jié)果顯示大黃酸可改善肝臟炎癥,特別是高劑量大黃酸能顯著降低NAFLD小鼠肝臟組織炎癥。然而,大黃酸是否通過抑制炎癥因子水平降低肝臟炎癥損傷還不清楚,也是后期研究的重點。有研究表明炎癥信號通路(如NF-κB和JNK通路)的激活在NAFLD的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用[8]。在多種炎癥刺激下,IKK復(fù)合體的激活引起IκB磷酸化和隨后的降解,釋放NF-κB并允許其進入細胞核[28]。在接下來的研究中,我們將重點探討大黃酸在NAFLD模型中對炎癥因子水平及炎癥通路的影響,進而完善大黃酸改善NAFLD小鼠肝功能和肝細胞脂代謝的調(diào)控機制。

綜上所述,本研究首次證實大黃酸可能通過激活Sirt1/AMPK信號通路有效改善NAFLD小鼠的肝功能及強化其肝臟脂肪代謝速率,對于由高脂飲食誘發(fā)的脂肪肝具有一定的改善作用,為后續(xù)相關(guān)研究提供一定實驗依據(jù)。