組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶KDM1家族在肝細胞癌中的作用*

王 涵 陳瑋鈺 付 蕾 王 萌 毛德文 姚 春△

1.廣西中醫藥大學研究生院 (廣西 南寧, 530001) 2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院 3.廣西中醫藥大學第一附屬醫院

肝細胞癌(HCC)作為臨床最常見的消化系統惡性腫瘤,占所有肝臟惡性腫瘤患者的85%～90%[1]。HCC患者的5年生存率為17%～20%,位居癌癥相關死亡原因第4位,目前全球每年約有84萬新增HCC病例,且這一趨勢仍在進行性上升[2,3]。該病發病隱匿,早期缺乏典型臨床癥狀和特異性檢測指標,被發現時通常已處于晚期階段,并且由于目前治療手段有限,費用高昂,儼然成為了影響公眾健康的社會難題。目前分子靶向免疫治療在HCC治療中取得了突破性進展,是肝病領域的研究熱點之一,不斷深入挖掘HCC進展過程中的調控分子,為新型抗癌藥物的研發提供潛在治療靶點,是今后肝病學科攻堅的重點方向。

了解癌癥的發病機制是制定針對性治療方案的關鍵環節,其特異性治療靶標的獲取在很大程度上取決于腫瘤基因組的變化,包括基因序列突變和影響基因表達的表觀遺傳修飾。組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶(KDM)在表觀遺傳修飾的轉錄、分化及炎癥形成等許多生物學過程中具有廣泛影響[4],其中KDM1家族通過介導不同的下游信號通路,對多種腫瘤的發生發展發揮關鍵調節作用[5]。近年來隨著細胞及分子水平技術的不斷發展,越來越多的研究表明KDM1家族與HCC的發生發展關系密切。然而,由于該家族功能多樣,調控機制復雜,當前對其在HCC中功能機制的研究尚未完善。因此,本文就KDM1家族與表觀遺傳修飾的關系及不同家族成員的生物學特性進行歸納和探討,重點聚焦KDM1家族調控HCC的研究進展,以期為該病的臨床防治和干預提供新的思路和依據。

1 KDM1家族與表觀遺傳修飾

表觀遺傳修飾是指機體受自然環境改變的影響,相同DNA序列的基因表達或細胞表型發生一系列的改變,這一改變具有功能穩定、可遺傳、可逆轉等特點。表觀遺傳修飾通過改變原癌基因和腫瘤抑制基因的轉錄,進而在癌癥的發生發展過程中發揮核心作用。DNA甲基化最早被提出作為表觀遺傳信息的載體,隨后大量的研究也證實,組蛋白修飾和非編碼RNA在直接或間接影響局部染色質結構重塑的過程中也起著重要作用,其中組蛋白修飾在癌癥的表觀遺傳修飾中最為常見[6]。

組蛋白修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、ADP核糖基化、瓜氨酸化、巴豆酰化、異丁基化等多種類型,通常以組合識別的形式共同調控基因的表達[7]。組蛋白甲基化是在組蛋白甲基化轉移酶(HMT)和組蛋白去甲基化酶(HDM)的共同催化下,組蛋白3(H3)或組蛋白4(H4)的N端賴氨酸或者精氨酸殘基發生了甲基化修飾(見圖1),從而調控遺傳印跡影響下游基因的表達。其中,組蛋白賴氨酸殘基的HDM可根據序列同源性及其催化機制分為兩大類:一類是KDM1家族,該家族由KDM1A(也稱LSD1、AOF2、BHC110)和KDM1B(也稱LSD2、AOF1)構成,是主要依賴黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔助因子的單胺氧化酶(MAOS),其功能是去除H3K4和H3K9上的單甲基化(me1)或雙甲基化(me2);另一類是含有Jumonji C結構域的賴氨酸脫甲基酶(JmjC KDM)家族,依賴Fe2+和α-酮戊二酸作為輔助因子進行催化,根據其功能的不同可再細分為7個亞家族(KDM 2～8)[5,8]。目前,對JmjC KDM家族在HCC致癌過程中驅動突變的研究少有報道,這一現象的出現可能與該家族成員結構高度相似有關[9]。JmjC KDM抑制劑大多數具有較差的細胞滲透性和強金屬螯合屬性[8],相似的結構導致了其催化中心表現出非選擇性的特點,在臨床治療中難以匹配到合適的酶活性抑制劑。因此,對KDM1家族的研究成為了表觀遺傳修飾調控HCC作用過程的主要突破口,更是當下KDM抑制藥物開發的研究熱點。

圖1 H3賴氨酸甲基化過程

2 KDM1家族成員的結構及其生物學特性

KDM1家族成員KDM1A和KDM1B是人類最早確定的組蛋白去甲基化酶,在許多疾病中均具有調節基因表達和蛋白質代謝的功能[10]。這兩種酶在結構上有一定的相似性,都存在一個胺基氧化酶結構域和一個由Swi3p、Rsc8p和Moira組成的SWIRM結構域,后者是染色質相關蛋白所獨有的特征。除此以外,KDM1A和KDM1B還表現出不同的結構體系,獨特的結構域在酶與不同基因組位點、蛋白質復合體的結合過程中展現出強大的功能多樣性。

KDM1A中存在一個特殊的結構,稱為柔性N端區,酶核定位的關鍵過程依賴于該結構的靈活性。KDM1A的催化中心區域位于C-末端的氨基氧化酶樣區(AOL),AOL結構域包含兩個小葉,一個小葉與SWIRM結構域相連接,另一個小葉作為催化底物的識別部位,二者共同在空腔中表現出脫甲基化活性。與KDM1B相比,KDM1A中的SWIRM結構域不能與DNA結合,但它有助于維持KDM1A的蛋白質穩定性,并作為與其他蛋白質相互作用的停靠位點,其核小體外的DNA通過AOL結構域與核心復合體結合并相互作用[11]。此外,KDM1A的AOL結構域還突出一個α-螺旋結構的Tower區,它與REST輔助抑制因子(CoREST)復合物形成相互作用位點,這一結構對KDM1A的H3K4去甲基化酶活性極其重要[12]。

KDM1A使H3K4me1/2和H3K9me1/2去甲基化具有特異性,其中H3K4me1/2是與活躍轉錄相關的組蛋白標志,H3K9me1/2是與非活躍轉錄相關的組蛋白標志。雖然KDM1B與KDM1A的序列有近25%的同源性,但研究表明,內源性的KDM1B對核小體底物具有顯著的H3K4去甲基化酶活性,與KDM1A的活性表達有明顯區別[13]。KDM1B是一種H3K4me2去甲基化酶,H3K4me2是表觀遺傳轉錄激活的關鍵標志,可通過p53-p21-Rb信號通路特異性調節細胞周期以驅動組蛋白H3K4去甲基化[14]。KDM1B存在于大多數腫瘤細胞中,它同KDM1A一樣,保護機體正常細胞,使其不發生癌變[15]。但除此之外,KDM1B可能參與了不同于KDM1A的轉錄程序,改變了NSD3等關鍵轉錄蛋白的甲基化動力學,調節了轉錄激活基因的相互作用過程[16]。因此,KDM1家族成員的結構和功能既有相同之處又有不同之處(見圖2),從KDM1A和KDM1B的結構及其生物學特性出發,方能更好地了解KDM1家族在HCC中發揮作用的分子機制。

圖2 KDM1家族的三維結構模型[17-18]

3 KDM1家族在肝細胞癌中的作用機制

隨著基因微陣列芯片和高通量測序技術的快速發展,對于KDM1家族在癌癥發生發展變化中發揮的作用機制有了進一步的認識。最新研究數據表明,H3K4的甲基化狀態紊亂是癌癥發生的常見原因,這些變化可能是由于改變甲基化狀態的酶位點突變或易位,或者酶的表達水平變化所造成的[19]。KDM1家族中KDM1A和KDM1B這兩種酶能從me1和(或)me2的H3K4中去甲基化,而腫瘤抑制因子的去甲基化酶通常是高度突變的[20]。因此,深入研究KDM1家族成員在組蛋白甲基化異常狀態下對HCC發病機制的影響,能為尋找抑制癌癥進展的分子靶點提供潛在的生物學價值。

3.1 KDM1A與肝細胞癌 根據癌癥干細胞(CSCs)模型研究指出,腫瘤生長是由癌細胞中一部分CSCs所驅動的,并且CSCs具有高度致癌性和抗化療性,在維持腫瘤生長、復發等多方面發揮了尤為重要的作用[21]。HCC中CSCs的惡性功能,不僅表現在對腫瘤發生的激活和對常規療法的抗性,還參與了上皮-間充質轉化(EMT)、免疫調節等多種生物學過程[22]。CSCs的致癌性和參與表觀遺傳修飾的成員密切相關,其中KDM1A作為染色質修飾因子,主要作用于H3K4和H3K9,這些組蛋白在CSCs的惡性調節和誘發癌癥基因組的不穩定性中扮演了重要角色。

Lei等[23]在體內和體外研究中發現,HCC組織中KDM1A的表達水平與腫瘤組織學分級、淋巴結侵襲和Lgr5+表達呈正相關,其中Lgr5+的豐富表達與疾病的進展、生存期的縮短有關。高表達的KDM1A增強了HCC中CSCs的耐藥性,其作用機制是通過抑制β-catenin信號通路傳導的負調節因子,誘導Lgr5+中Prickle1、APC、Sfrp5等表達水平增加,從而促進HCC的進展并維持CSCs的干性。另一項研究結果表明,KDM1A負責維持HCC中CSCs的自我更新和致癌性,其過表達甚至能夠驅動非CSCs的自我更新[24]。癌癥相關成纖維細胞(CAF)促進了Notch信號通路介導去乙酰化酶SIRT1的表達,導致CSCs中去乙酰化水平降低和KDM1A激活,此外SIRT1還參與CSCs的干性維持。與此同時,KDM1A的高酶活性與乙酰化程度呈負相關,當CSCs中乙酰化水平受到抑制時,KDM1A也能通過蛋白小體途徑增加自身的表達量,驅動肝癌CSCs表現出惡性功能。

Zhao等[25]通過免疫組織化學(IHC)和蛋白質印跡法探討了人類HCC細胞系中KDM1A的表達及其與臨床病理學特征之間的關系,發現KDM1A在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁非癌組織,并且在HCC細胞系中,KDM1A敲低后,c-Myc和Bcl-2的表達下調,癌細胞增殖減少。此外,與較高的腫瘤分期(T3-T4)和腫瘤分級(G3)相比,較低的腫瘤分期(T1-T2)和腫瘤分級(G1-G2)也顯示出KDM1A的低表達。隨后,Kim等[26]通過IHC分析303例HCC患者中KDM1A的表達情況,發現有77%的患者顯示KDM1A蛋白染色陽性,進一步研究表明KDM1A的高表達可通過視黃酸(RA)途徑下調H3K9me1/2和H3K4me1/2水平,加快腫瘤的生長速度,與HCC患者的無病生存率和總生存率降低有關。在深入探索KDM1A利用表觀遺傳因素控制癌細胞代謝的作用機制時發現,在人類肝癌HepG2細胞中,下調KDM1A的表達可以使H3K4去甲基化直接增強線粒體代謝轉變,同時下調葡萄糖攝取和糖酵解活性,降低癌癥的代謝和增殖能力[27]。

因此,肝癌組織內的微環境在驅動KDM1A通過β-catenin、Notch、RA等信號通路維持CSCs干性和促進腫瘤增殖中發揮了關鍵的作用,KDM1A的高表達造成了HCC的惡性發展和不良預后。盡管KDM1A在HCC中的發病機制與其在乳腺癌、前列腺癌等調控途徑上具有一定的相似性,但隨著近年來表觀遺傳修飾誘導自噬網絡相關基因表達的發現,仍需更全面、更深入的研究以闡明KDM1A作用于HCC的具體效應機制[28,29]。

3.2 KDM1B與HCC KDM1B在多種腫瘤的發生發展過程中起著不可或缺的作用,其在基因沉默、轉錄因子活性調控、細胞周期調節等方面的作用機制成為了當前研究的一大熱點[30],尤其是KDM1B的過表達在預測侵襲性腫瘤的生物學意義和臨床不良預后中扮演的角色。越來越多的研究證據表明,KDM1B的功能障礙與異常染色質重塑有關,異常的DNA甲基化導致組蛋白活性失調,進而造成腫瘤抑制基因的沉默和異常基因的表達,促進了腫瘤的發生[31,32]。

國內外學者對于KDM1B的研究著重關注了其與細胞周期調節和腫瘤發生的關系,與此同時也對KDM1B的調節機制進行了嚴謹的實驗驗證。Cai等[30]研究發現KDM1B的過表達能夠通過p53-p21-Rb調控結直腸癌的細胞周期分布,其作用機制是KDM1B通過直接與p53啟動子結合,介導H3K4me2去甲基化以下調p53的表達,促進癌細胞增殖和抑制細胞凋亡。這一結果也與Wang等[33]的研究發現相符,表明敲低KDM1B可通過p53/Smad信號通路傳導抑制癌細胞擴增并誘導胰腺癌細胞凋亡。Patel等[34]利用RNA測序技術證實KDM1B的低表達可能導致代謝抑制,而且該機制是獨立于KDM1A的特殊基因組所調控的。因此,結合KDM1B與KDM1A在特異性催化底物中的相似性,以及KDM1A在多種癌癥發生過程中mRNA表達水平的變化,不難發現KDM1B和KDM1A可能分別與不同的蛋白質結構域相互作用,雖然在調節關鍵生物學過程中發揮相似的功能,但顯示出截然不同的基因組分布圖譜。

與KDM1B在其他侵襲性腫瘤中的致癌機制相似,在HCC中KDM1B呈現過表達。根據一項旨在確定涉及HCC細胞表觀遺傳學改變的潛在治療靶點的綜合研究顯示,在HuH7和Hep3B肝癌細胞系的遺傳和表達數據中發現KDM1B的高表達,這一表達水平的改變還與HCC患者的臨床不良預后相關[35]。然而,目前有關探討KDM1B在HCC動物模型中的相關研究較少,其真實世界研究更是缺乏。基于計算機算法的生物信息學研究結果表明,KDM1B主要調控與細胞代謝活動相關的基因,通過調控呼吸電子傳遞鏈、線粒體ATP合成耦合電子傳遞、電子載體活性、NADH脫氫酶活性和氧化還原酶活性等生物學過程發揮致癌作用。但這一研究結果僅是進行預測和篩選,其實際價值和意義有待商榷,尚需采用生物學研究加以佐證[34]。

由上可知,KDM1B與許多癌癥中重要的生物學過程有關,但盡管在KDM1B結構和功能方面的認識取得了重大進展,而涉及腫瘤的潛在分子機制卻尚未能明確闡釋,尤其是KDM1B在HCC方面的數據極其匱乏,這是一個未來需要探索的潛在研究課題。

4 KDM1家族在HCC中的治療作用

由于HCC患者在初始階段的檢測方法有限,結合該病特有的高惡性率和復發性質,患者的預后往往不盡人意。提高癌癥預后的重要手段是及時診斷和治療,然而,HCC對許多腫瘤生物標志物的敏感性和特異性都明顯不足,鑒于癌癥中組蛋白賴氨酸去甲基化的表觀遺傳修飾過程可誘導基因突變,可見靶向KDM1家族能夠為HCC提供有效的治療方法和新的預后思路。

KDM1A的過度表達能夠促進癌癥的發生發展,而沉默KDM1A則會減少癌細胞的增殖、侵襲和遷移,因此抑制KDM1A被認為是治療肝癌的臨床干預措施之一,KDM1A抑制劑也成為了潛在的抗癌藥物[36]。迄今為止,HCC患者對抗癌藥物的獲得性耐藥是臨床非手術治療所面臨的一個巨大挑戰,甚至還可能縮減患者的生存時長,迫切需要進一步的研究來解決該問題。奧沙利鉑(OXA)屬于第3代鉑類化學抗癌藥物,是治療HCC的重要化療藥物之一,但由于個體的耐藥性,往往導致治療失敗。Ma等[37]研究發現OXA治療HCC時獲得耐藥性的機制之一是通過上調長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達,其中LINC01134被鑒定為抗OXA(OXA-R)細胞中上調最多的lncRNA。LINC01134/SP1/p62軸通過改變細胞的活力和線粒體穩態,促使細胞凋亡,從而激活肝癌組織中的抗氧化應激途徑,以調節OXA耐藥性,而KDM1A主要負責OXA-R細胞中LINC01134的上調。因此,用特定的抑制劑沉默KDM1A可能是一種抗HCC化療耐藥的新選擇,如DCN1抑制劑化合物383、含雜環反苯環丙胺衍生物等新型小分子抑制劑已被設計和運用于靶向KDM1A的癌細胞活性抑制[38,39]。值得注意的是,近期發現具有抑制微管蛋白聚合和抑制KDM1A雙重活性的叔磺酰胺衍生物表現出有效的抗HCC活性,是針對性治療的潛在藥物[40]。

索拉非尼是唯一獲得FDA批準用于治療晚期肝癌的藥物,但也因其耐藥性,只能將生存期延長約2.8個月,遠遠不能滿足患者的需求[41]。Koga等[42]使用MicroRNA-302介導的誘導多能干細胞技術,通過沉默KDM1A的表達誘發c-Myc抑制和H3K4甲基化,進而對HCC細胞進行重編程,實現藥物敏感性的提高。在另一項涉及HCC細胞系對索拉非尼耐藥的研究中也發現,KDM1A抑制劑可通過減弱Wnt/β-catenin信號通路顯著抑制耐藥HCC細胞中CSCs的干性,使體內索拉非尼耐藥的癌細胞重新獲得敏感性[43]。同時該研究還發現在索拉非尼耐藥細胞系中KDM1B表達的豐度變化很小,其耗竭并沒有造成藥物敏感性的變化。

雖然目前KDM1B的特異性抑制劑還未被研發和使用,但隨著其在結直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中異常基因表達模式的深入研究,KDM1B也成為了治療各種類型癌癥的一個很有前景的表觀遺傳學靶點。此外,KDM1A和KDM1B還可能與其他靶向藥物發揮協同作用[44],共同克服癌癥治療過程中出現的耐藥性問題,這也為在疾病聯合療法中使用KDM1抑制劑提供了新的治療思路。

5 總結和展望

KDM1家族參與了正常和疾病狀態下轉錄程序的表觀遺傳修飾調控,它們的活動對各種細胞功能起著至關重要的作用,尤其是在癌癥的增殖和轉移過程中通過不同信號通路發揮著相似的促癌作用。KDM1家族作為一種治療HCC的新型潛在靶點,主要通過表觀遺傳修飾調節組蛋白去甲基化,維持肝臟CSCs的干性,促進腫瘤細胞擴增。

雖然針對KDM1家族不同成員對HCC的作用已進行了廣泛的臨床實驗研究,同時也取得豐碩的成果,但由于HCC的治療受到致病因素多樣性、發病機制復雜性及治療方案個體差異性等多方面因素的影響,相關研究仍存在諸多不足:①目前針對KDM1家族在HCC發病機制的研究多集中于KDM1A,KDM1B在HCC中的基礎實驗和臨床研究鮮有報道;②對KDM1家族靶向治療藥物的研究多針對于肝癌細胞,其長期治療對正常肝細胞是否有影響亟需充分探討;③在KDM1抑制劑的研發中,應著重在體內和體外實驗中深入機制研究,挖掘KDM1家族在癌癥中治療潛力的同時保證其安全性。總而言之,未來深入了解KDM1家族不同成員通過表觀遺傳修飾調控的下游靶基因和作用通路,確定其在HCC致癌轉化中的關鍵作用,將有助于探索出新的分子靶點,設計出更適合于HCC的治療策略。