ATP5B在結直腸癌組織中的表達及意義

林 英,李時孟,岳斯琦,楊 琦*

(1.北京中醫藥大學東直門醫院 檢驗科,北京100700;2.吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科,吉林 長春130033)

結直腸癌是全球第三大癌癥死因,每年有超過185萬病例被發現,85萬人死亡[1]。結直腸癌初期起病隱匿,發展緩慢,多數病例是在癌癥晚期才被確診,有效的診斷及發病機制的研究對腫瘤的預后有重要意義[2]。本研究通過二維色譜質譜聯用技術、免疫印跡實驗、免疫組化實驗來探究ATP5B蛋白在結直腸癌組織與癌旁組織的表達及意義,為結直腸癌的臨床診斷及發病機制的研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選用2021年4月至2022年10月在吉林大學中日聯誼醫院初次就診且未經處理的結直腸癌患者組織及其配對的癌旁正常組織,癌組織選取癌灶中心區域,癌旁組織來自于距離癌組織7 cm以上的正常黏膜。共計41例。完成采集后用冷的PBS進行沖洗,液氮速凍,保存至-80°冰箱,本研究通過吉林大學中日聯誼醫院倫理委員會審批(20220126004)。

1.2 儀器與試劑

EASY-nLC 1200高效液相色譜儀購自美國Agilent公司,LTQXL離子阱質譜儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司,電泳儀,ATP5B單抗購自美國Affinity公司,兔抗人ATPB5多克隆抗體購自英國Abcum公司、HRP-羊抗兔 IgG購自美國CST公司,β-actin多抗、BCA蛋白質定量試劑盒購自sab公司,DNA酶,RNA酶購自美國西格瑪公司。組化試劑盒DAB顯色劑購自中國Servicebio公司。無水乙醇、二甲苯購自致遠化學試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1蛋白提取及樣品制備 將樣品從-80°冰箱中取出并倒入預冷的研缽中將其研磨為粉末狀,用刮勺將粉末轉移至加入適量蛋白裂解液的ep管中。充分混勻后冰上靜置30 min。在ep管中加入適量的DNA酶和RNA酶后放入4°離心機(12 000 rpm)離心10 min。根據BCA試劑盒中步驟測定蛋白樣品的濃度,將樣品板放入酶標儀中,記錄各個樣品在OD562條件下的OD值并繪制蛋白質濃度標準曲線,在ep管中加入1/4原體積的上樣緩沖液,95°條件下煮沸5 min,室溫靜置15 min后放入-80°冰箱中待用。

1.3.2二維質譜色譜聯用技術鑒定蛋白多肽 0.1%的甲酸蛋白加入樣品使其充分溶解,取50 μg樣品進行上樣,通過強陽離子柱和反向柱對樣品進行洗脫。經LTQXL離子阱質譜儀分析檢測,獲取全掃描及二級掃描處理后的質譜數據圖。

1.3.3免疫印跡試驗 SDS-PAGE電泳,將促凝劑冷卻至室溫后按照比例加入到分離膠中充分混勻,1.0 mm玻璃板中加入4.5 ml的混合溶液,迅速加入適量超純水后靜置45 min,倒棄超板內超純水。用濾紙吸去板內多余液體,加入配制好的濃縮膠后垂直插入電泳梳,靜置50 min。樣品經10%分離膠、5%濃縮膠將蛋白按照不同的分子量大小進行轉印。用快速封閉液浸潤PVDF膜10 min,倒入一抗低溫孵育過夜,PBS-T洗膜3次,每次10 min,加入二抗(1∶8 000)低溫孵育1 h。PBS-T洗膜5次,每次10 min,通過ECL發光法暗室顯影。

1.3.4免疫組化試驗 將組織樣本烤片后脫蠟水化,將切片放入枸櫞酸鹽抗原修復緩沖液中煮沸3 min,待其冷卻至室溫后拿出切片用PBS溶液清洗3次,用濾紙吸去殘留液體后放入濕盒內。確定組織邊緣后畫圈,在圈內滴加3%BSA室溫封閉30 min,加入ATP5B一抗稀釋液(1∶500)后低溫孵育過夜。PBS洗片3次,每次5 min,滴加二抗室溫孵育50 min,PBS洗片5次,每次3 min,甩干后滴加DAB顯色劑并控制反應時間,超純水沖洗切片后用蘇木素復染2 min,用鹽酸乙醇洗滌切片5次后放入PBS緩沖溶液中。脫水封片后由兩名病理科醫生在顯微鏡下進行圖像采集與分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 二維色譜與質譜聯用技術分析結果

本實驗癌組織及癌旁組織中以圖譜數為依據判斷同一蛋白的豐度,當兩個樣品中蛋白圖譜數比值 ≥1且蛋白圖譜數差值 ≥72 時,在篩選時將其判定為差異蛋白。在此標準下檢測到NUP107、CUL48、FCG、E5RH53、ENO1、TOMM40、RPS14、FGB共8個上調蛋白,CNN1、DESM、VCL、A1AT、SYNM、KCRB、MYH14、ATP5B等8個下調蛋白。ATP5B作為其中1個下調蛋白,質譜圖結果見圖1。

圖1 ATP5B 質譜圖結果

2.2 免疫印跡試驗結果

運用Western blot方法對14對組織的ATP5B表達量進行分析,ATP5B在結直腸癌組織中表達量低于癌組織,如圖2所示。

圖2 ATP5B 免疫印跡結果

2.3 免疫組化試驗結果

結果顯示,ATP5B蛋白在癌組織中強陽性表達占17%(7/41),中等陽性表達占22%(9/41),弱陽性表達占61%(25/41)。在癌旁組織中,強陽性表達占22%(9/41),中等陽性表達占41%(17/41),弱陽性表達占37%(15/41)。在癌組織和癌旁組織中ATP5B的陽性率差異具有統計學意義(P<0.05),見圖3。

圖3 ATP5B 免疫組化結果

3 討論

癌癥的發展通常伴有能量代謝方式的變化,為癌細胞提供代謝能量并合成代謝前體產物是結直腸癌發生發展的主要表現之一[3]。線粒體是細胞能量代謝的核心細胞器,ATP合酶是調節其生物學功能的關鍵酶復合物之一[4]。ATP合成酶由兩個相連的多亞基復合物組成,其催化部分由5個不同的亞基組成:3個α亞基,3個β亞基,γ、δ 和ε亞基各1個,其功能主要是在氧化磷酸化的過程中以α亞基和β亞基高度協調的構象變化為表現催化ATP合成或水解[5]。ATP5B基因主要編碼與線粒體能量代謝核心相關的F1β亞基[6]。近年來,陸續有研究發現ATP5B與乳腺癌[7]、膠質母細胞瘤[8]、急性粒細胞白血病[9]、腎透明細胞癌[10]等惡性腫瘤的發生發展密切相關,MOTTAGHI-DASTJERDI等[11]通過生信分析推測ATP5B為胃癌發病機制的中樞基因,有研究[12]證實ATP5B在胃癌腫瘤組織中的高表達與患者的腫瘤大小、TNM分期,淋巴結轉移和預后不良呈正相關,促進了腫瘤細胞的遷移、侵襲和增殖,過表達ATP5B激活FAK/AKT/MMP2通路促進了胃癌的生長,因此認為其可能對胃癌診斷有一定的輔助作用。

本研究選擇通過液質聯用技術(LC-MS)分析41例患者的結直腸癌及癌旁組織差異表達蛋白,得到了結直腸癌相關的差異表達蛋白質圖譜,發現ATP5B是下調蛋白之一。利用免疫印跡試驗和免疫組化試驗對LC-MS的結果進行驗證,發現在結直腸癌旁組織中ATPB1的表達量顯著高于癌組織中的表達量,因此,ATP5B低表達可能與結直腸癌的發生發展存在聯系,為結直腸癌的初篩和研究提供了新的靶點。ATP5B更深入的生信分析及腫瘤進展機制的研究尚不完善,需要后續實驗進行更全面的探討。