LncRNA COL11A1-208在胃癌中的表達及對細胞增殖、侵襲和遷移的影響

陳 沖,徐 康,童 誠,崔建華,張祖芳

(東臺市人民醫院 消化內科,江蘇 東臺224200)

胃癌(gastric cancer,GC)是發病率較高的惡性腫瘤,是癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。盡管診斷技術和手術治療方案不斷進步、優化,但GC患者的預后并不理想,整體5年生存率仍較低下[2-3]。因此,識別GC的分子機制并研發新的治療策略是必要的。

目前,基因治療已成為癌癥治療領域的一個新的研究熱點[4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類長度不少于200個核苷酸的RNA,因缺乏開放閱讀框而不具備編碼蛋白功能,但LncRNA可通過選擇性剪接、調控RNA轉錄和降解、表觀遺傳修飾等過程參與細胞分化、增殖、上皮-間充質轉化、凋亡等多種生命活動,是細胞生物學的關鍵性調節因子[5-6]。近年來,研究證實LncRNA在包括GC在內的多種癌癥患者的血清和癌組織中異常表達,與癌癥的發生、進展緊密相關[7-9]。COL11A1-208為LncRNA家族新成員,先前研究表明其在口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中高表達,可促進OSCC細胞增殖和侵襲,且與OSCC患者的不良預后相關,是OSCC有前景的診斷、預后生物標志物或治療靶點[10-11]。然而,COL11A1-208在GC中的意義尚不清楚。本研究旨在通過觀察COL11A1-208在GC中的表達及其表達改變對GC細胞增殖、侵襲和遷移的影響,分析COL11A1-208在GC發生和進展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2019年6月至2021年12月于東臺市人民醫院行手術切除的49例GC患者的癌組織及其癌旁組織(距癌組織≥3 cm)標本,所有組織標本均經液氮速凍后保存于-80℃。本研究獲得醫院倫理委員會批準,且患者在術前均簽署知情同意書。

人正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)及5種人胃癌細胞(AGS、MGC-803、MKN-45、BGC-823、SGC-7901)(貨號ATCC-431、ATCC-209、H-MGC-803、ATCC-829、ATCC-274、ATCC-805)均購自上海康朗生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

Gibcao澳洲FBS(貨號10099141,上海吉至生化科技有限公司);100×青-鏈霉素雙抗、1%結晶紫(貨號P1400-100、G1062,北京索萊寶科技公司);Lipofectamine-2000、Trizol(貨號11668027、YB-0102c,上海鈺博生物科技公司);pcDNA3.1載體及pcDNA3.1-COL11A1-208、siRNA COL11A1-208(si-COL11A1-208)及其陰性對照(si-NC)由上海吉瑪制藥公司提供;CCK-8試劑盒(貨號A311-01/02,南京諾唯贊生物科技公司);RIPA裂解液、BCA試劑盒、兔源一抗anti-GAPDH、山羊抗兔二抗(abs9231、abs9233、abs124037、abs20002)愛必信生物科技公司;兔源一抗anti-Ki67、anti-細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、anti-基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)和anti-神經型鈣黏附蛋白(N-cadherin)(貨號ab16667、ab16663、ab76003、ab245117,Abcam公司)。

1.3 細胞培養與轉染

GES-1細胞、AGS細胞、MGC-803細胞、MKN-45細胞、BGC-823細胞、SGC-7901細胞均采用RPMI-1640培養基(含10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗),于37℃、5%CO2培養箱中培養,每24 h更換1次培養液,匯合度約90%時收集細胞。

將SGC-7901細胞以1×106個/孔接種至6孔板內,待細胞匯合度約80%時利用Lipofectamine-2000進行轉染,將SGC-7901細胞分為Ctrl組(未進行轉染)、pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1載體)、pcDNA3.1-COL11A1-208組(轉染pcDNA3.1-COL11A1-208)、si-NC組(轉染si-NC)、si-COL11A1-208組(轉染si-COL11A1-208),繼續培養48 h后,收集各組SGC-7901細胞,并通過qRT-PCR驗證轉染效果。

1.4 qRT-PCR檢測COL11A1-208表達

1.5 CCK-8實驗、克隆形成實驗檢測各組SGC-7901細胞增殖

CCK-8實驗:將收集的1.3各組SGC-7901細胞接種至96孔板中(1×104個/孔),培養24 h后加入CCK-8溶液并繼續培養2 h,借助SKSW-KC酶標儀測定450 nm波長處的吸光度(OD)。細胞增殖率(%)=(OD轉染處理組-OD空白組)/(OD Ctrl組-OD空白組)×100%。

克隆形成實驗:將收集的1.3各組SGC-7901細胞接種至6孔板中(1×103個/孔),培養24 h后置于4%多聚甲醛中固定20 min,而后置于1%結晶紫中染色10 min,于Olympus CKX31倒置顯微鏡下計數≥50個細胞的克隆數。

1.6 Transwell實驗檢測各組SGC-7901細胞侵襲

預先于Transwell小室底膜包被Matrigel,將收集的1.3各組SGC-7901細胞用不含FBS的培養基調成濃度為5×105個/mL的單細胞懸液,取200 μL接種至Transwell小室中,24孔板(下室)中加入600 μL含有10%FBS的培養基,培養24 h后取出Transwell小室,置于甲醛中固定30 min,用棉簽輕輕拭去上層細胞,風干后置于1%結晶紫中染色10 min,借助Olympus CKX31倒置顯微鏡計數細胞數量,即為侵襲數量。

1.7 劃痕愈合實驗檢測各組SGC-7901細胞遷移

將收集的1.3各組SGC-7901細胞接種至24孔板中(5×104個/孔),培養24 h后用100 μL槍頭在孔中間豎著劃1條直線,PBS清洗去除劃下的細胞,繼續培養24 h,而后于Olympus CKX31倒置顯微鏡下拍照,借助Image J軟件計算細胞劃痕面積愈合率。

1.8 Western Blot檢測各組SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移相關蛋白

收集1.3各組SGC-7901細胞,加入RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法測定濃度后進行定量、變性,隨后進行凝膠電泳分離蛋白、轉膜、封閉,孵育兔源一抗anti-GAPDH、anti-Ki67、anti-Cyclin D1、anti-MMP9和anti-N-cadherin(4℃過夜),次日室溫孵育山羊抗兔二抗2 h,滴加ECL發光液后置于BJ75-JY04S-3C凝膠成像分析系統中拍照,借助Image J軟件進行灰度分析。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 COL11A1-208在GC癌組織和細胞中的表達情況

與癌旁組織比較,GC癌組織中COL11A1-208表達增加(P<0.05);與GES-1細胞比較,AGS細胞、MGC-803細胞、MKN-45細胞、BGC-823細胞、SGC-7901細胞中COL11A1-208表達均增加(P<0.05),且SGC-7901細胞增加更多。見表1,表2。

表1 COL11A1-208在GC癌組織中的表達情況

表2 COL11A1-208在GC細胞中的表達情況

2.2 SGC-7901細胞成功過表達或敲低COL11A1-208

與Ctrl組、pcDNA3.1組、si-NC組比較,pcDNA3.1-COL11A1-208組SGC-7901細胞中COL11A1-208表達增加(P<0.05),與上述4組相比,si-COL11A1-208組SGC-7901細胞中COL11A1-208表達減少(P<0.05)。見表3。

表3 SGC-7901細胞成功過表達或敲低

2.3 過表達或敲低COL11A1-208對SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移的影響

與Ctrl組、pcDNA3.1組、si-NC組比較,pcDNA3.1-COL11A1-208組SGC-7901細胞增殖率、克隆數、侵襲數、劃痕面積愈合率均增加(P<0.05),與上述4組相比,si-COL11A1-208組SGC-7901細胞增殖率、克隆數、侵襲數、劃痕面積愈合率均減少(P<0.05)。見圖1、2、3,表4。

圖1 過表達或敲低COL11A1-208對SGC-7901細胞增殖的影響

圖2 過表達或敲低COL11A1-208對SGC-7901細胞侵襲的影響(×400)

圖3 過表達或敲低COL11A1-208對SGC-7901細胞遷移的影響

表4 過表達或敲低COL11A1-208對SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移的影響

2.4 過表達或敲低COL11A1-208對SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移相關蛋白的影響

與Ctrl組、pcDNA3.1組、si-NC組比較,pcDNA3.1-COL11A1-208組SGC-7901細胞中Ki67、Cyclin D1、MMP9、N-cadherin表達均增加(P<0.05),與上述4組相比,si-COL11A1-208組SGC-7901細胞中Ki67、Cyclin D1、MMP9、N-cadherin表達均減少(P<0.05)。見圖4、表5。

圖4 過表達或敲低COL11A1-208對SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移相關蛋白的影響

表5 過表達或敲低COL11A1-208對SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移相關蛋白的影響

3 討論

GC是最常見的癌癥類型之一,在中國每年約有38萬GC新發病例,占全球每年癌癥診斷總數的40%[12]。GC早期癥狀隱匿,侵襲轉移較快,加之現有血清學腫瘤指標的敏感性和特異性都不高,導致GC患者預后較差,生存期較短[13]。因此,尋找新的腫瘤標志物,對GC患者的早期診斷、治療和預后監測具有重要意義。

近年來,從基因層面尋找腫瘤標志物深受研究者青睞。人類基因組計劃顯示,編碼蛋白質的基因只占整個基因組的2%,其余98%的基因被稱為非編碼RNA,根據轉錄本大小,可分為短非編碼RNA和LncRNA,其中LncRNA占總RNA的68%以上[14]。LncRNA通過與多種蛋白及核酸相互作用參與細胞功能調控,已有大量研究表明LncRNA是諸多癌癥的關鍵性調控因子,其異常表達與腫瘤的增殖、侵襲、轉移和耐藥等各種生物學行為有關,被認為是很有前景的診斷、預后生物標志物或治療靶點[15-16]。以GC為例,如LOC285194通過抑制Wnt/β-連環蛋白信號通路抑制GC細胞增殖、侵襲,促進其凋亡[17];LINC00974通過上調細胞分裂蛋白激酶6促進GC細胞周期進展而加速GC細胞增殖[18];LINC00641通過海綿吸附微小RNA-429以Notch-1表達而促進GC的惡性進展[19];NR027113通過上皮-間質轉化通路促進GC細胞侵襲和遷移,同時與GC患者淋巴結轉移、遠處轉移及預后不良呈正相關[20-21]。

COL11A1-208為LncRNA家族新成員,有研究發現其在OSCC的發生和進展中發揮著重要的腫瘤促進作用,有望成為OSCC的一個潛在生物標志物[10-11]。而COL11A1-208在GC中的確切作用仍未可知。本研究結果顯示,COL11A1-208在GC癌組織中及GC細胞(AGS、MGC-803、MKN-45、BGC-823、SGC-7901)中均高達,且在GC細胞中以SGC-7901細胞表達最高,提示COL11A1-208可能作為一種致癌基因參與GC的癌變過程。腫瘤的發生和進展是一個多因素、多步驟、漸進的過程,伴隨著一系列基因表達異常,其中Ki67和Cyclin D1為評估細胞增殖狀況關鍵的兩個指標,二者的表達水平與細胞增殖活力呈正相關[22-23];MMP9是一種基質金屬蛋白酶,可降解血管基底膜和細胞外基質而增強細胞的侵襲、遷移能力,N-cadherin是一種廣泛存在于上皮組織中的鈣黏附蛋白,主要通過介導細胞間的黏附而促進細胞侵襲和遷移[24-25]。本研究選取COL11A1-208表達量最高的SGC-7901細胞進行轉染實驗,結果發現過表達COL11A1-208后SGC-7901細胞增殖率、克隆數、侵襲數、劃痕面積愈合率及Ki67、Cyclin D1、MMP9、N-cadherin表達均增加,即過表達COL11A1-208可促進SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移,而敲低COL11A1-208表達后SGC-7901細胞的增殖、侵襲和遷移能力下降,證實COL11A1-208作為一種致癌基因參與GC的癌變過程,但其具體的調控分子機制和臨床潛力仍有待進一步探索。

綜上所述,COL11A1-208在GC中高表達,其可促進SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移,COL11A1-208有望成為GC一個有前景的診斷、預后生物標志物或治療靶點。