巨泌乳素與假性高泌乳素血癥實驗室診斷路徑研究進展

羅 薇,程歆琦,夏良裕

(中國醫學科學院北京協和醫院 檢驗科,北京100730)

泌乳素(prolactin,PRL)是一種肽類激素,在調節女性乳房發育和泌乳中具有重要作用,同時還有滲透調節、血管生成和免疫調節等功能[1]。泌乳素的生理性增高主要見于運動、妊娠、產后及應激狀態等;病理性升高時主要臨床表現為溢乳、閉經和不育,見于垂體腫瘤、乳腺腫瘤、庫欣綜合征、肢端肥大癥、下丘腦腫瘤等。泌乳素檢測是診斷高泌乳素血癥的依據,臨床實驗室常用免疫法測定泌乳素,但是該方法常受巨泌乳素的干擾[2]而出現假性高泌乳素血癥,可能導致誤診誤治。因此,實驗室有必要建立巨泌乳素血癥鑒別診斷的方法與路徑,識別假性高泌乳素血癥,降低臨床誤診風險。本文綜述巨泌乳素對泌乳素測定的干擾以及其實驗室診斷研究進展,以期對實驗室建立巨泌乳素血癥診斷路徑提供幫助。

1 巨泌乳素血癥

1.1 巨泌乳素血癥的定義與發生率

泌乳素根據其結構和分子量主要分為3種類型,即單體泌乳素、大泌乳素、巨泌乳素(macroprolactin,M-PRL)。泌乳素由于遺傳易感性或翻譯后修飾(例如糖基化、磷酸化、脫酰胺基化),導致其產生新的表位,分泌到血液后觸發了自身抗體IgG的產生,IgG與單體泌乳素絲氨酸殘基端結合生成巨泌乳素[3],分子量可達150 kDa甚至更高。正常人體內60%～90%為單體泌乳素,15%～30%為大泌乳素,巨泌乳素含量一般<10%[4]。巨泌乳素血癥(macroprolactinemia)是指外周血單體催乳素水平正常,大量泌乳素與IgG結合生成過量的巨泌乳素。如果未被發現,可能會導致誤診和管理不當。研究顯示,在一般人群中,巨泌乳素血癥的總體患病率在3%～4%之間,但在高泌乳素血癥的患者中顯著增加,最高可達35%[1]。在英國和美國檢測的所有高泌乳素血癥病例中有5%～15%可能是由于巨泌乳素血癥引起的[5]。巨泌乳素血癥在女性中較為常見,但是男性和兒童中也會出現巨泌乳素血癥。DONADIO等[6]回顧性研究發現在24名高泌乳素血癥男性中有11人(45.8%)存在巨泌乳素血癥。

1.2 巨泌乳素血癥的臨床特點

巨泌乳素血癥的出現與許多生理和病理狀況有關,包括壓力、懷孕、劇烈運動、垂體腺瘤和癌癥以及對乳房的機械刺激、胸壁外傷、肝腎疾病、原發性甲狀腺功能減退、顱內腫瘤壓迫垂體或下丘腦、空蝶鞍綜合征、用泌乳素刺激藥物等[7]。GIBNEY等[8]回顧了310例巨泌乳素血癥患者的臨床特征,發現0～45%的患者有溢乳癥狀,6%～40%的患者有不育癥,15%～80%的患者有月經量少或閉經癥狀。但是并沒有直接證據顯示這些癥狀是由巨泌乳素引起的。同時,閉經和溢乳在巨泌乳素血癥患者中的發生率(57%和29%)明顯低于真正的高泌乳素血癥的患者中的發生率(84%和63%)。由于部分巨泌乳素血癥患者的癥狀與高泌乳素血癥相似,最初被發現患有高泌乳素血癥,但在隨訪和進一步診治中發現其排卵或自發受孕,最后確診是巨泌乳素血癥。

因此,巨泌乳素的生物學活性很低,通常無明顯臨床癥狀,除非患者自身抗體IgG與泌乳素之間發生間歇性解離,才會由于單體泌乳素的增加而表現出明顯的高泌乳素的臨床癥狀。也有部分巨泌乳素血癥的患者表現出和高泌乳素血癥相一致的臨床癥狀,是由于巨泌乳素血癥患者伴有單體泌乳素的增高所導致。美國臨床內分泌學家協會和美國內分泌疾病學會推薦,當臨床表現、影像學發現和/或對治療的反應不一致時應考慮巨泌乳素血癥的存在[9]。因此,在所有高泌乳素血癥的患者中,特別是在缺乏癥狀的患者中,建議實驗室常規篩查巨泌乳素。

2 巨泌乳素對泌乳素檢測的干擾

2.1 泌乳素的檢測

高泌乳素血癥由于其臨床表現缺乏特異性,診斷主要依靠實驗室對泌乳素含量的測定。目前實驗室測定血清泌乳素主要采用免疫學方法,通常采用兩點法或夾心法原理。待測泌乳素分別與固相上的捕獲抗體和用于檢測的標記抗體發生反應,形成捕獲抗體-泌乳素-標記抗體復合物。通過洗滌步驟去除未反應的試劑后,標記抗體產生的信號強度與泌乳素的濃度直接相關。該方法可以在很寬的濃度范圍內提供快速、精確的結果,并且在外部質量評估方案中顯示出很好的方法一致性。盡管大多數泌乳素免疫測定方法已按照世界衛生組織的國際標準進行了標準化,但各個平臺檢測泌乳素仍存在一定的差異,泌乳素參考范圍取決于測定平臺且差異很大,可能與檢測抗體對泌乳素不同表位的反應性差異有關[10]。

值得注意的是所有免疫測定法都容易受到異嗜性抗體的干擾,制造商通常會添加“封閉劑”以最大程度地減少此類干擾。在目前的泌乳素免疫測定中,雖然異源抗體的干擾非常罕見,但巨泌乳素的干擾很常見,導致高泌乳素血癥的誤診,可能引發進一步甚至不適當的治療。

2.2 巨泌乳素干擾檢測的原理

通常情況下巨泌乳素都是單體泌乳素和IgG的復合物,少數情況下,巨泌乳素是被高度糖基化的異常高分子量形式(200～669 kDa),但這類泌乳素特征與常見的泌乳素-IgG復合物形式相似,都具有單體泌乳素的抗原表位,因此巨泌乳素保留了許多商業化免疫測定中使用的抗泌乳素抗體的部分(或全部)免疫反應性,在使用免疫法進行泌乳素測定時,巨泌乳素會與捕獲抗體和標記抗體發生反應,產生信號;另外一方面,IgG和單體泌乳素形成的復合物具有比單體泌乳素更長的半衰期[7],會造成巨泌乳素在血中的聚集,從而導致泌乳素水平的測值升高。

2.3 不同檢測平臺受干擾現狀

由于不同檢測平臺所使用的反應抗體有所不同,同時巨泌乳素的空間結構有差異,巨泌乳素雖然在不同檢測平臺的泌乳素免疫測定中都會發生反應,但是反應程度不同[6]。SMITH等[11]利用目前使用較為廣泛的9種泌乳素免疫測定法評估含有巨泌乳素血清的反應性,結果發現不同方法測定結果有2.3～7.8倍的差異,并且所有結果均高于對單體泌乳素濃度的估計。對于當前泌乳素的主要檢測平臺,Tosoh AIA對于巨泌乳素的反應最強烈,西門子Centaur、貝克曼 Access和羅氏 Elecsys相對較弱。KELLY等[12]使用目前的參考范圍和嚴格的巨泌乳素血癥定義,通過兩種不同的測定系統診斷巨泌乳素血癥,使用Tosoh AIA分析,在3 101個連續的常規樣本中有670個表現出高泌乳素,其中165例(24.6%)確診為巨泌乳素血癥。當用反應性較低的Roche Elecsys Ⅱ測定法重新測定高泌乳素血癥樣品時,只有79例(11.8%)確診為巨泌乳素血癥。HATTORI等[13]研究發現抗泌乳素自身抗體可識別人泌乳素N和C末端殘基上的表位。泌乳素測定中的反應性不同可能是因為巨泌乳素的自身抗體在不同程度上掩蓋了免疫測定捕獲或檢測抗體靶向的表位[14]。

雖然在不同檢測系統上巨泌乳素的反應性有所不同,但是聯合多平臺檢測并不能提高巨泌乳素的檢出率。一項回顧性研究選取了70例高泌乳素血癥患者分別在雅培I 2000和貝克曼系統檢測,結果發現雅培I 2000檢出巨泌乳素血癥29例,貝克曼檢出巨泌乳素血癥20例,兩系統同時判定巨泌乳素血癥15例,聯合檢測檢出率與二者相比無統計學差異,可見聯合檢測并不能提高巨泌乳素的檢出率,而會提高檢測成本[15],更重要的是選擇合適的巨泌乳素檢測方法,優化實驗室高泌乳素血癥的診斷流程。

3 巨泌乳素的測定方法

選擇合適的巨泌乳素測定方法對于實驗室巨泌乳素的篩查具有重要意義。測定巨泌乳素的參考方法是色譜法,文獻報道一種利用高效液相色譜(HPLC)的方法,通過超濾去除巨泌乳素再進行血清泌乳素的測定,具有常規適用性[16]。聚乙二醇沉淀法是目前應用較多的檢測方法,此外還有蛋白質A/G色譜柱或125I泌乳素結合劑法。

3.1 凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法(Gel filtration chromatography,GFC)被認為是巨泌乳素測定的金標準和參考方法,這是一種基于體積差異的分離方法。固定相由一列多孔珠組成,孔徑范圍明確。它具有分餾范圍,可以分離該分子量范圍內的分子。足夠小的蛋白質可以通過珠子的孔內,并被稱為“內含物”。這些較小的蛋白質可接近珠粒內部的流動相以及珠粒之間的流動相,最后在凝膠過濾分離中洗脫,太大而不能塞入珠孔的蛋白質被排除在外,只能進入微珠之間的流動相,因此首先洗脫。將含有巨泌乳素的樣品用此類色譜柱時,巨泌乳素將首先洗脫,然后是大泌乳素和單體泌乳素,當巨泌乳素線下的面積大于泌乳素洗脫總面積的30%時,即巨泌乳素陽性[17]。GFC法不僅可以測定所有形式的泌乳素,而且可以估算其分子量,但其費時費力,且成本較高,應用受到一定的限制,通常不適合常規臨床實驗室。

3.2 聚乙二醇沉淀法

目前應用最為廣泛的是聚乙二醇(poly-ethylene-glycol,PEG)沉淀法,PEG沉淀法是將待測血清與25%PEG混合后,孵育一定時間,然后離心沉淀巨泌乳素復合物,取離心后的上清液測定泌乳素,和未處理的血清樣品泌乳素測定結果進行比較。一般認為PEG沉淀后回收率≤40%是診斷巨泌乳素血癥的標準。但是有研究[18]認為此標準存在缺陷,因為它無法識別出以巨泌乳素為主要形式但同時單體泌乳素也升高的情況,而這一情況更具有病理意義。因此目前有兩種方式報告巨泌乳素血癥的存在即PEG沉淀后回收率或PEG沉淀后泌乳素濃度,用回收率診斷多認為≤40%或≤60%時存在巨泌乳素血癥,使用回收率≤60%的標準可檢測到更多的巨泌乳素血癥患者[19]。但是當巨泌乳素與高濃度的單體泌乳素同時發生時,推薦同時使用PEG沉淀前后的泌乳素濃度作為參考,防止漏診或誤診。

PEG沉淀法簡單、快速且成本較低,同時還可以用于檢測類似的由于內源抗體與測定試劑反應而產生的干擾。但值得注意的是該方法的特異性有限,部分單體泌乳素可能與免疫球蛋白共沉淀,使回收率降低,特別是在血清球蛋白濃度升高疾病(單克隆丙種球蛋白病或多克隆性高丙種球蛋白血癥)患者中可能造成假性巨泌乳素血癥的錯誤診斷[20]。

3.3 巨泌乳素檢測方法的選擇

目前常用的巨泌乳素檢測方式每一種都有其優勢和不足。KAVANAGH等[21]用41例巨泌乳素血癥患者血清比較了幾種檢測巨泌乳素的方法的特異性和臨床實用性,研究發現所有預處理血清中的泌乳素殘留濃度與GFC后獲得的單體濃度均有不同,但是PEG沉淀法與GFC法一致性最高,因此雖然所檢查的方法均未產生與GFC方法相同的結果,但PEG預處理產生的結果最好,被推薦作為GFC的首選替代方法。目前聚乙二醇沉淀廣泛用于檢測巨泌乳素,并且可以用于檢測類似的大分析物以及由于內源抗體與測定試劑反應而產生的干擾[22]。

4 巨泌乳素血癥實驗室診斷路徑

診斷高泌乳素血癥必須根據已知原因進行鑒別診斷,尤其是巨泌乳素導致的高泌乳素血癥。如果存在巨泌乳素血癥,單體催乳素的濃度是正常的,則無需其他進一步檢查。僅憑臨床表現無法將巨泌乳素血癥和真正的泌乳素過多癥區分,因此需要基于實驗室檢測的解決方案,建立巨泌乳素血癥的實驗室診斷路徑,見圖1。包括受干擾樣本的篩選,選擇適合巨泌乳素測定方法,設定PEG沉淀后單體泌乳素的參考范圍和報告方式。

圖1 PEG沉淀法篩查巨泌乳素血癥診斷路徑圖

4.1 受干擾樣本的篩選

高泌乳素血癥診斷指南建議對所有無癥狀高泌乳素血癥患者進行巨泌乳素血癥檢測[23]。但是由于部分巨泌乳素血癥患者經常伴有高泌乳素的臨床癥狀,會導致誤診漏診,進行不必要的進一步診治,因此建議對所有高于參考上限的進行巨泌乳素血癥的篩查[24]。MILICA等[25]研究發現將臨界值從制造商的參考上限提高到32.9 μg/L并不會明顯改變巨泌乳素血癥的檢出率;若臨界值提高至47.0 μg/L會使超半數巨泌乳素血癥患者被漏診。因此研究建議根據各實驗室免疫測定平臺的不同,建立自己的篩查臨界值,同時發現對于隨訪患者1年內巨泌乳素變化差異不大的,可不再進行重復篩查。

4.2 檢測流程與臨床報告

實驗室研究應著重于對具有生物活性的泌乳素即單體泌乳素的測定,這可以為臨床醫生提供最有用的信息。PEG沉淀后的泌乳素濃度提供了生物活性單體泌乳素的相對準確的量度。但是由于各個檢測平臺對于泌乳素的反應性不同,因此應設定單體泌乳素特定的參考區間,才可有效減少假性高泌乳素的發生。建立實驗室巨泌乳素檢測的篩查流程,設置特定的巨泌乳素參考范圍及診斷標準,對于為臨床提供準確的單體泌乳素濃度具有重要意義。MILICA等[25]進行了1項回顧性研究,巨泌乳素血癥由PEG沉淀后回收百分率和PEG沉淀后的泌乳素濃度診斷,通過對1 136例患者在羅氏cobas e601上PEG沉淀前后泌乳素濃度的測定,建立了實驗室巨泌乳素診斷路徑,如圖1所示。在報告結果時應同時報告PEG沉淀后回收百分率和PEG沉淀后的泌乳素濃度,并注明實驗室PEG沉淀后單體泌乳素的參考區間,有助于臨床醫生對于巨泌乳素血癥的診斷,有效減少假性高泌乳素血癥的誤診和誤治。

綜上所述,巨泌乳素是免疫法泌乳素中最常見的干擾因素。實驗室應根據實驗室檢測系統為所有高泌乳素血癥病例引入篩查流程,建立篩查方法,設定自己的巨泌乳素參考范圍及診斷標準。