甜瓜高效不定芽再生體系的建立

賀玉花，徐龍蘭，唐伶俐，徐永陽，田小琴，張 健，孔維虎，李文東，趙光偉

（1.中國農業科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009；2.三亞中國農業科學院國家南繁研究院 海南三亞 572000；3.濰坊創科種苗有限公司 山東昌樂 262400）

甜瓜（Cucumis meloL.）屬于葫蘆科甜瓜屬，是世界上重要的園藝經濟作物之一。我國是世界甜瓜生產和消費第一大國，據聯合國糧食與農業組織（FAO）統計數據，2021 年我國甜瓜種植面積為38.66 萬hm2，產量達1400 萬t，占世界總產量的49%。當前甜瓜育種多依賴雜交、回交等傳統育種手段，存在育種周期長、盲目性大、改良數量性狀效果較差等缺點[1-2]。與傳統育種相比，分子育種更精準高效，是當前和未來甜瓜育種中的重要策略。解析基因功能是開展分子育種的前提，遺傳轉化是進行基因功能驗證、明確基因功能最直接的手段，而構建甜瓜高效不定芽再生體系是實現遺傳轉化的基礎。

甜瓜不定芽再生體系受基因型、外植體類型、植物生長調節劑的種類與濃度等因素的影響。不同基因型甜瓜的內源激素水平存在差異，因而其再生能力也有所不同[3-4]。研究表明，不同基因型甜瓜間再生率差異顯著，且薄皮甜瓜再生率要高于厚皮甜瓜[5-10]。選擇不定芽誘導能力較高的外植體類型，是建立再生體系的關鍵。而不同類型的外植體，其細胞結構和種類存在一定差異，未分化的分生組織及分化程度較低的薄壁組織細胞更適于誘導再生[11-12]。前人研究發現，甜瓜的各個部位均可用于組織再生獲得完整植株，其中子葉、下胚軸使用較多[5，13-17]。另外，植物生長調節劑的種類和濃度是影響外植體分化的重要因素，常用于甜瓜再生的植物生長調節劑有6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。在不定芽誘導階段，一般均需添加6-BA，添加質量濃度一般在0.5～2.0 mg·L-1，添加少量的IAA 或ABA能夠更好地平衡內源激素水平，提高不定芽再生率[17-20]。不添加植物生長調節劑也可以實現不定芽的伸長和生根，再生率約為70%[21-22]，而添加少量的植物生長調節劑能夠促進不定芽伸長和生根，并且縮短再生時間。添加低質量濃度的6-BA（0.05～0.5 mg·L-1）能夠促進不定芽伸長且降低玻璃化程度，再生苗狀態較好，再生率為80%左右[3，18-19，23-24]。以1/2 MS 培養基為基礎，添加少量IAA 或IBA（0.2～0.5 mg·L-1最佳），能夠促進不定芽生根[16-20，25-26]。

盡管甜瓜再生體系構建已有不少報道，但在甜瓜離體再生過程中仍存在愈傷組織分化出芽困難、不定芽誘導率低和再生體系重復性差等問題。筆者以8 個甜瓜基因型為試驗材料，通過對甜瓜基因型，外植體類型，不定芽誘導、伸長及不定根誘導過程中植物生長調節劑種類和質量濃度等關鍵影響因素進行探究，以期篩選出再生能力強、不定芽再生率高的甜瓜基因型并建立重復性高的甜瓜不定芽再生體系，為甜瓜遺傳轉化體系的建立提供一定科學依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料及地點

試驗材料共8 份不同的甜瓜種質，包括3 個厚皮甜瓜材料：B8（紅心脆，原新疆地方品種）、P110（Vedrantais，原法國材料）、905（引自西甜瓜中期庫，原美國品種PMR45）；5 個薄皮甜瓜材料：IVF05（引自中國農業科學院蔬菜花卉研究所）、E5（甜寶，原日本材料）、E55（牛角蜜，原地方品種）、E79（白沙蜜，原地方品種）、974（黃皮梨瓜，原地方品種）。材料均經中國農業科學院鄭州果樹研究所甜瓜遺傳育種課題組連續多代自交純化。

試驗于2021 年9 月至2022 年3 月在中國農業科學院鄭州果樹研究所遺傳轉化實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 挑選狀態健康的甜瓜種子，加適量常溫無菌水浸泡30 min 后剝去外種皮，移至超凈工作臺后，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用2%的次氯酸鈉浸泡15 min（其間不斷搖晃），無菌水沖洗4～5 次，播種于1/2 MS 培養基上，在正常光周期條件（25 ℃，光照16 h·d-1，黑暗8 h·d-1，光照度3000 lx）下培養3 d，至子葉由黃轉綠時獲得無菌苗。

1.2.2 不定芽的誘導培養 選擇上述8 個基因型的甜瓜材料分別獲取無菌苗，將無菌苗子葉沿腹縫線遠胚軸端劃開（圖1），開口深度為0.5 cm 左右，接種于添加不同質量濃度的6-BA 和ABA（設置10 個組合，具體處理見表1）的MS 培養基上，在正常光周期條件下培養，進行不定芽誘導，觀察不定芽誘導情況。每個處理3 個培養皿，每個培養皿接種10 個外植體，14 d 繼代1 次，28 d 后統計出芽情況，計算不定芽出芽率。根據不定芽出芽率，篩選再生能力最佳的基因型及不定芽誘導階段最適培養基。

圖1 外植體處理示意圖Fig.1 Diagram map of cotyledon treatment

不定芽出芽率/%=出芽外植體個數/接種外植體個數×100。

1.2.3 外植體類型的篩選 選擇再生能力最佳基因型材料和最適培養基，設置子葉近胚軸端、子葉遠胚軸端和胚軸3 種外植體（圖2），對其不定芽誘導能力進行探究。在無菌環境下去除無菌苗生長點、根系及大部分胚軸，保留子葉和2 cm 左右胚軸，同時將子葉垂直葉脈切割，分成近胚軸端和遠胚軸端兩部分。將不同類型的外植體接種于最適不定芽誘導培養基上進行不定芽誘導。每個外植體類型3 個培養皿，每個培養皿接種10 個外植體，14 d 繼代1 次，28 d 后觀察不定芽誘導情況，計算不定芽誘導率，篩選最佳外植體類型。

圖2 外植體類型示意圖Fig.2 Diagram map of cotyledon types

1.2.4 不定芽伸長 不定芽誘導28 d 后，將生長狀態較好的不定芽叢切下，轉移至MS 伸長培養基上，在正常光周期條件下培養，設置添加6-BA 質量濃度梯度0.1（處理A）、0.2（處理B）、0.5（處理C）、1.0 mg·L-1（處理D）4 個處理，每個處理設置3 個培養皿，每個培養皿接種10 個不定芽。21 d 后觀察不定芽叢伸長情況，確定不定芽伸長最適培養基。

1.2.5 不定根誘導 不定芽伸長至2～3 cm、具有3～4片真葉時，將其轉移至1/2 MS 生根培養基上進行不定根誘導。設添加IBA 質量濃度梯度0.0、0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1等5 個處理（A～E），每個處理3 次重復，每個重復10 個不定芽。培養14 d 后觀察生根情況。

1.3 統計與分析

利用Excel 2016 和SPSS Statistics 26 進行試驗數據統計及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同基因型及植物生長調節劑質量濃度配比對甜瓜不定芽誘導的影響

基因型和植物生長調節劑直接影響不定芽誘導率，試驗以8 個基因型甜瓜為研究對象，對10 個不同組合的培養基進行不定芽誘導，28 d 后統計出芽率（表1）。結果表明，4 個薄皮基因型甜瓜（E5、E55、E79、974）的平均出芽率分別為23.3%、20.7%、31.0%、35.3%，顯著低于厚皮基因型甜瓜B8、P110和薄皮基因型甜瓜IVF05，其中除E79 在處理5 的出芽率為80.0%、974 在處理3 的出芽率為83.3%外，4 個薄皮基因型甜瓜（E5、E55、E79、974）在其他處理條件下的出芽率均低于60.0%，表明4 個薄皮基因型甜瓜（E5、E55、E79、974）的再生能力較弱。905 只有在處理6、7 和處理10 條件下出芽率高于60.0%，且其平均出芽率低于50.0%，表明905 的再生能力也較弱。而B8、P110 和IVF05 的平均出芽率均在55.0%以上，再生能力較強，其中B8 誘導再生獲得的不定芽叢長勢好，單芽多，再生苗狀態較好，是更合適的再生材料。

處理1 和處理2 只添加了6-BA，其平均出芽率顯著低于其他另外添加了ABA 的處理，表明添加一定量的ABA 能促進甜瓜不定芽誘導。處理3和處理9 的平均出芽率均為53.8%，高于其他處理，且B8、P110 和IVF05 均可在處理9 下獲得最高出芽率，分別為96.7%、86.7%和93.3%，因此選擇處理9 培養基（MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA）為不定芽誘導的最適培養基。

2.2 不同外植體類型對甜瓜不定芽再生的影響

與先誘導愈傷組織再誘導不定芽的間接再生相比，直接誘導產生不定芽的直接再生方式可以縮短轉化進程，因此，外植體應選擇產生不定芽數量多的類型。以B8 為研究對象，MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA 為不定芽誘導培養基，觀察3種外植體的再生能力，28 d 后統計不定芽出芽率。結果如表2 所示，胚軸做外植體誘導產生大量愈傷組織，誘導出芽率極低，是不適合的外植體類型。以子葉近胚軸端做外植體，出芽率為93.3%，顯著高于其他2 種外植體，且產生愈傷組織較少，因此，子葉近胚軸端是最適合用于不定芽再生的外植體類型。

表2 不同外植體類型對B8 不定芽再生的影響Table 2 Effect of different explant types on adventitious bud regeneration in B8

2.3 植物生長調節劑對不定芽伸長的影響

以B8 為研究對象，設置4 個不同質量濃度6-BA 處理（A～D），在不定芽誘導21 d 后觀察不定芽伸長情況（圖3），并統計單芽數量（表3）。結果表明，添加不同質量濃度的6-BA，叢生芽均可得到伸長，各處理間不定芽伸長量沒有明顯差異，但隨著6-BA 質量濃度逐漸升高，發現獲得的單芽數量逐漸減少，當6-BA 添加質量濃度為0.1 mg·L-1時，獲得的伸長單芽數為16.3，顯著高于其他處理。在不定芽伸長量正常的基礎上，單芽數量越多，越有利于切割出更多的無菌苗用于后期生根。因此，B8材料不定芽伸長階段最適培養基配比為MS+0.1 mg·L-16-BA。

表3 不同質量濃度6-BA 處理對B8 不定芽伸長的影響Table 3 Effect of different concentrations on adventitious bud extensions in B8

圖3 不同濃度6-BA 對B8 不定芽伸長的影響Fig.3 Effects of different concentrations of 6-BA on the extension of adventitious buds in B8

2.4 植物生長調節劑對不定根誘導的影響

以B8 為研究對象，設置5 個不同質量濃度IBA 處理（A～E），在不定根誘導14 d 后觀察不定根誘導情況（圖4），并統計生根率和平均主根數（表4）。結果表明，不同的處理條件下再生苗生根率均較高（均在85.0%以上），但誘導產生的根系形態及數量有明顯差異。處理A 產生根系數量不穩定，大多數根系僅含有一條主根，側根較多。處理B 和處理C 的主根數量有一定的增加，但發育較好、側根發達的主根數量相對較少。處理D 平均主根數量為3.1，顯著高于其他處理，且根系發育好、側根發達，是最佳的生根處理。處理E 不定根生長受到抑制，平均主根數僅為0.9。綜上，IBA 的適量添加可以促進不定根的產生，但質量濃度過高（1.0 mg·L-1）會抑制生根，當添加質量濃度為0.5 mg·L-1時，促進生根效果最好，1/2 MS+0.5 mg·L-1IBA 是較合適的不定根誘導培養基。

表4 不同質量濃度IBA 處理對B8 不定根誘導的影響Table 4 Effect of different concentrations in the rooting of adventitious buds in B8

圖4 不同質量濃度IBA 對B8 不定根誘導的影響Fig 4 Effect of different concentrations of IBA on the rooting of adventitious buds in B8

3 討論與結論

穩定且高效的再生體系是遺傳轉化成功實現的前提。植物再生分為通過誘導愈傷組織的間接再生和通過誘導不定芽的直接再生，甜瓜中主要采用直接誘導再生的方式。甜瓜不定芽再生體系受基因型、外植體類型、植物生長調節劑的種類與濃度等因素的影響。筆者研究發現，2 個厚皮甜瓜材料（B8、P110）和1 個薄皮甜瓜材料（IVF05）不定芽誘導能力均較強，平均出芽率顯著高于其他4 個薄皮甜瓜基因型材料（E5、E55、E79、974），這與前人得出的薄皮甜瓜再生率高于厚皮甜瓜的結論不同[7-10，12]。筆者認為，這與試驗中所選材料不同有關，對于甜瓜厚皮材料與薄皮材料的再生能力的強弱并沒有定論。

在誘導外植體直接再生的過程中添加適量的植物生長調節劑可以提高外植體出芽率，同時提高不定芽的伸長速度和新生苗生根率，從而縮短再生周期。不定芽誘導階段一般會添加6-BA，同時添加少量的IAA、ABA 能獲得更好的效果，不定芽誘導率在70%～90%[3，18，24，27-28]。筆者在本研究發現，對于8 個不同基因型材料，出芽率最高的培養基均添加了少量的ABA，表明在不定芽誘導過程中，添加適量的ABA 能夠促進不定芽誘導，這與前人研究結果一致[18，29]，但是對于不同基因型材料，出芽率最高的培養基添加ABA 的質量濃度不同，表明在進行甜瓜再生時，針對不同基因型，應進行預試驗，篩選最適合的植物生長調節劑種類與質量濃度。B8 材料在MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA 培養基上進行不定芽誘導，其誘導率高達96.7%，高于前人研究中其他基因型材料的不定芽誘導率。添加少量的植物生長調節劑可以有效促進再生芽的伸長，而筆者研究發現不同質量濃度6-BA 處理不定芽伸長量并沒有明顯差異，這與Zhang 等[30]的研究結論一致，但0.1 mg·L-16-BA 處理產生的單芽數量顯著高于其他3 個處理。

甜瓜的子葉、下胚軸均能進行脫分化，再生獲得完整植株。在含有STM基因（莖尖分生組織）的干細胞中，分生組織的誘導率更高，生長更快，而子葉中STM基因主要分布在子葉近胚軸端U 型切口的深層細胞中，因此更適于用作再生。筆者在對B8 材料外植體類型的研究中發現，胚軸不定芽誘導率極低，產生大量愈傷組織，而靠近胚軸端的子葉卻有著極高的不定芽誘導率，這與前人研究結果一致[28，31]。

綜上所述，筆者通過對甜瓜再生過程中基因型、外植體類型、植物生長調節劑種類和濃度等關鍵影響因素進行研究，篩選出再生能力較強的厚皮甜瓜材料B8，并以其為基礎建立了一個穩定高效的甜瓜再生體系，其中再生過程中最佳外植體類型為子葉近胚軸端，不定芽誘導最佳培養基為MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA，不定芽伸長最佳培養基為MS+0.1 mg·L-16-BA，不定根誘導最佳培養基為1/2 MS+0.5 mg·L-1IBA。