應用SSR 分子標記分析煙臺地區黃瓜種質資源遺傳多樣性

滿孝源，王湘懿，張凱歌，胡 凌，陳曉峰

（中國農業大學煙臺研究院 山東煙臺 264670）

黃瓜（Cucumis sativusL.，2n=14）是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生植物，是一種世界性蔬菜，又名王瓜、胡瓜、青瓜，在果菜類蔬菜中具有很高的地位[1]。我國是黃瓜生產大國，其栽培面積占世界黃瓜栽培總面積的一半以上，產量和規模均居世界第一位。山東黃瓜地方品種由于栽培歷史較久和引入途徑不同，加之山東省不同地區氣候差異較大，在長期自然和人工定向選擇下，形成類型多、品種資源豐富的特點[2-3]。以白黃瓜和地黃瓜為代表的煙臺地方黃瓜，因其具有品質優良、營養豐富、口感鮮脆等特點，市場地位不斷提高[4-5]。隨著市場需求擴大，黃瓜栽培及其選育品種逐漸增多，原優良品種在選育過程中純度逐漸降低，在生產中重名現象普遍，煙臺地區種質資源研究相對落后，導致優質種質流失嚴重[6]。

21 世紀以來，分子生物學得到了突飛猛進的發展，越來越多的分子標記技術相繼出現，并逐漸廣泛應用于作物遺傳育種、植物親緣關系鑒別、基因庫構建等各個領域，例如RFLP、ISSR、RAPD、AFLP、SSR 等[7-10]。SSR（Simple Sequence Repeat）稱為簡單重復序列，具有單基因座、等位基因變異多、多態性豐富、信息量大、穩定性好、操作簡單、進化所受選擇壓力小、特異性強等優點[11]。在眾多的分子標記中，SSR 能精準識別目標基因DNA 片段大小，檢測結果可靠、穩定且準確，所以SSR 熒光標記常應用于植物遺傳分析、分子信息身份證的構建、品種鑒別等方面的研究[12]。王宇晴等[13]利用22 對SSR 核心引物，研究了111 份甜菜登記品種的相關遺傳信息，邱楊等[14]從22 對引物中篩選出8 對，構建了75 份蘿卜種質資源的分子身份證，徐曉丹等[15]用6 對多態性引物將36 份小豆品種區分成4 個類群。

筆者在本研究中對膠東地區主要栽培的黃瓜品種和全國多地性狀及生長特點相似的品種進行遺傳多樣性分析，利用SSR 分子熒光標記技術，構建煙臺地區黃瓜的遺傳指紋圖譜和分子身份證，再對其進行品種劃分，最后采用聚類分析法確定各黃瓜品種間的親緣關系，為煙臺地區黃瓜的品種鑒定、種質資源保護和種質創新等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為22 份煙臺地區主要栽培的黃瓜種質（表1），其中21 份種質來自山東、湖南和河北等省（市）不同種業公司，1 份是中國農業大學煙臺研究院自育未授權品種。2022 年10—12 月，于中國農業大學煙臺研究院溫室播種黃瓜種子，采用隨機區組方式于72 穴盤種植，每份種質播6 穴，培育至2 片真葉期后，每份種質隨機取2～3 片真葉用于本研究。

表1 黃瓜種質資源及其主要農藝性狀Table 1 Germplasm resources and main agronomic characters of cucumber

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取與檢測 采用上海生物工程有限公司Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒（批號B518261）提取DNA，取新鮮黃瓜真葉0.5 g，經過DNA 提取后，用1.4%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA 的完整性，再用分光光度計檢測樣本純度，保證OD260/280在1.8 以上，合格后將所有樣本稀釋，以備后續試驗。

1.2.2 SSR 引物篩選 從近年來發表文獻上選用特異性較好的引物[16-25]，引物篩選遵循擴增多態性原則，挑選30 對引物。先通過常規PCR 擴增檢測各引物的多態性，選取多態性較高的9 對引物（表2）。

表2 黃瓜種質資源SSR 分子標記檢測的引物來源及其序列Table 2 Primers for SSR molecular labeling detection of cucumber germplasm resources

1.2.3 PCR 擴增體系 PCR 擴增體系如下：1 μL 模板DNA（20～50 ng·μL-1），引物F（10 μmol·L-1）和引物R（10 μmol·L-1）各0.5 μL，0.5 μL 混合dNTP（5 μmol·L-1），2.5 μL 含MgCl2的Taq緩沖液（10倍），0.2 μLTaq酶（5 U·μL-1），加入ddH2O 至25 μL。PCR 具體反應采用Touch-down PCR[26]：94 ℃預變性5 min；93 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 次循環；93 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 次循環；72 ℃修復延伸，10 min；4 ℃保存。合成包含FAM（藍色）、HEX（綠色）、TAMRA（黑色）3 種不同熒光染料的SSR 引物，所用SSR 引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 熒光SSR 引物檢測 采用連續加樣器，吸取990 μL HIDI（甲酰胺）和10 μL LIZ-500（分子質量內標）混合均勻，以每孔10 μL 分別加入到96 孔反應 板 中。1200 r?min-1離 心15 s 后 每 孔再加入1 μ L 樣品，緊接著再次離心15 s，密封離心30 s 后置于PCR 儀中，98 ℃變性5 min 后立即置于冰水中冷卻，待完全冷卻后離心15 s，使用ABI 3730 XL 型DNA 分析儀進行毛細管電泳分析。

1.3 統計分析

對分析儀毛細管電泳輸出結果人工讀取峰值進行統計，以Excel 2016 進行數據整理并保存[27]。使用DataFormater 軟件[28]將整理的數據轉化為各相關軟件可以識別的格式，并用PopGen32 計算有效等位基因、等位基因、期望雜合度、觀測雜合度、Nei’s基因多樣性指數和Shannon’s 信息指數；用軟件Power Marker 3.2 統計多態性信息含量（PIC）和基因型數量；用UPGMA 法對22 份黃瓜種質進行聚類分析[29]。

1.4 DNA分子身份證構建

參考武志江等[30]的方法，將9 對引物的擴增帶型按從小到大順序排列，并從“1～9”依次按順序賦值，超過“9”的從小寫字母“a”開始按照字母順序繼續編碼，將未檢測出結果賦值為“0”，最后將9 位數字串聯到一起，得出9 位獨特的字符串即為該種質的DNA 分子身份證。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選

利用初步篩選的30 對SSR 引物對22 份種質進行擴增，進一步挑選出擴增條帶清晰、穩定性好的引物9 對，部分SSR 引物擴增結果見圖1。

2.2 SSR標記多態性分析

由表3 所示，利用9 對SSR 引物對22 份黃瓜種質進行PCR 擴增，共檢測到40 個等位基因位點，平均每對引物檢測出4.44 個，檢測出基因型數量平均4.78 個；其中引物SSR10954 擴增出的等位基因的數目最多，為9 個，引物CSWTAAA01 檢測出的等位基因的數目最少，為2 個；有效等位基因（Ne）的范圍為1.10～3.34，平均2.17；期望雜合度（He）的范圍為0.09～0.72，平均0.48；觀測雜合度（Ho）的范圍為0.09～0.73，平均0.29；Nei’s 基因多樣性指數（H）的范圍為0.09～0.70，平均0.47；Shannon’s 信息指數（I）的范圍為0.22～1.44，平均0.89；多態性信息含量（PIC）的范圍為0.09～0.66，平均0.42。9 對引物的平均多態性較好，適合進行相關遺傳分析和分子身份證的構建。部分種質的熒光檢測電泳圖見圖2。

圖2 部分黃瓜種質中熒光引物SSR10954 的SSR 擴增結果Fig.2 SSR amplification results of fluorescent primer SSR10954 in partial cucumber germplasms

2.3 SSR指紋圖譜的構建

參考黃健婷等[31]的方法，對電泳后的數據進行校正和整理，人工讀出等位基因條帶，建立22 份黃瓜種質的DNA 指紋圖譜（表4），同時制作數字指紋圖譜。將表4 中的條帶轉化為數字0、1，其中“1”代表有擴增條帶，“0”代表在相應位點無條帶，“9”代表未檢測出結果，同時按引物編號順序和擴增條帶片段從小到大順序，組成一串數字，構成數字指紋圖譜[32]（表5）。

表5 22 份黃瓜種質的數字指紋圖譜Table 5 Digital fingerprint of 22 cucumber germplasms

2.4 構建分子身份證

按照表4 所示的引物序列重新排列，將每對引物在不同樣品上擴增得到的帶型按照由少到多的順序排列并將其編碼串聯得到帶型編號（表6），進一步得出22 份黃瓜種質的分子身份證（表7）。其中，奇山壓爬架和大禹爬滿地兩個品種共用一套分子身份證，具體品種差別需要進一步從基因組分析堿基差異，進而才能驗證是否存在差異和親緣關系。由表7 可見，21 份黃瓜種質的分子身份證均不相同，9 對SSR 引物能夠區分21 個樣本，表明采用的9 對SSR 引物是合理且有效的。

表6 9 對引物的擴增帶型編號Table 6 Amplified band number of 9 pairs of primers

按照《商品二維碼》和《追溯二維碼技術通則》[33-34]的要求，采用二維碼快速生成器生成22 份黃瓜種質分子身份證的二維碼（表7）。

2.5 不同種質遺傳關系聚類分析

使用NTSYSpc2.0 計算不同黃瓜種質間的遺傳相似系數（表8）。由表8 可知，22 份黃瓜種質的遺傳相似系數為0.25～1.00，其中，奇山壓趴架（7）和大禹爬滿地（20）之間的遺傳相似系數最大，為1.00，表明二者幾乎沒有遺傳差異，具體差別需要進一步分析；湘園813（14）和瀏陽白皮（13）之間的遺傳相似系數最小，為0.25，說明二者的遺傳差異較大，親緣關系較遠。

表8 22 份樣本間的遺傳相似系數Table 8 The variance range of genetic similarity coefficients among 22 samples

根據9 對引物對22 份種質的擴增結果，用NTSYSpc2.0 分析得出22 份黃瓜種質的遺傳關系樹狀圖（圖3）。分析表明，當相關系數為0.79 時，將22份黃瓜種質分成六類。第Ⅰ類包含7 個黃瓜品種，第Ⅱ類包含6 個黃瓜品種，第Ⅲ類有3 個品種，第Ⅳ類只有奇山翡翠F1，第Ⅴ類有4 個品種，第Ⅵ類只有玉女。在第Ⅰ和第Ⅱ類中主要是山東省（尤其是膠東地區）主栽的黃瓜雜交品種，有著相同或相似的父母本，其中奇山壓趴架和大禹爬滿地的性狀和生長特點有著比較高的相似度，遺傳差異極小；第Ⅲ類中的3 個品種，其農藝性狀比較相似；第Ⅴ類中的3 個品種，瀏陽白皮、蔬研十二號和上栗白黃瓜主要是湖南省當地雜交品種，另外一個湖南省品種湘園813 歸類在第Ⅲ類里，推測是其育種所采用的父母本與第Ⅲ類黃瓜有著較近的親緣關系。第Ⅳ類中的奇山翡翠F1 推測可能是由湖南省品種雜交而成。第Ⅵ類中的玉女雖然屬于山東省培育的黃瓜品種，但與其他幾類的黃瓜親緣關系皆較遠。

圖3 基于9 對SSR 引物的黃瓜種質資源聚類分析Fig.3 Cluster analysis of cucumber germplasm resources based on 9 pairs SSR primers

3 討論與結論

煙臺地區的黃瓜栽培歷史悠久，且地方品種特點明顯，種類多樣，如何對當地主栽品種進行分類、鑒定，進而培育優良的地方品種是當前黃瓜育種工作的重點。

SSR 分子標記由于其具有檢測結果穩定、準確性高、效率高，多用于種質遺傳多樣性的鑒定，在指紋圖譜和分子身份證構建上已經得到了廣泛應用。吳仕蔓等[35]通過擴增帶型分析，構建了22 份柚類種質的分子身份證，包括12 條信息獨特的身份證。唐梅等[36]以48 對SSR 引物構建了24 個香稻品種的指紋圖譜。李喬喬等[37]采用37 對SSR 引物對33 份多胚甜菜種質進行遺傳多樣性分析，將其分成兩大類，說明了該分子標記技術的可靠性。SSR 分子標記技術同樣在黃瓜的遺傳多樣性分析中有著廣泛的應用，崔洪宇等[38]利用其中的24 對SSR 引物構建的指紋圖譜可有效區分所有16 個供試品種。王蕾等[2]基于SSR 分子標記技術篩選出17 對引物，將32 份黃瓜種質聚為5 類。史建磊等[39]利用11 對SSR 特異性引物對黃瓜自交系進行聚類分析，將48 份黃瓜自交系聚為4 個類群。筆者篩選出9 對SSR 引物，利用其對22 份煙臺主栽黃瓜種質進行了遺傳多樣性分析，9 對引物共篩選出40 個等位基因，高于史建磊等[39]研究的結果數，與王蕾等[2]研究中引物多態性較為相近，說明本研究所中采用的SSR 引物多態性良好，可以作為22份種質的分類依據。通過建立的黃瓜聚類分析圖表明，遺傳相似系數近的種質具有類似的性狀特征。在相關系數為0.79 時，可將22 份種質分為六類，I 類群的春秋翠玉、奇山白天使、金棚白玉、碧秀、翠玉白葉三和中科白玉F1 均為短棒狀，被聚為一類；V 類群的瀏陽白皮、蔬研十二號和上栗白黃瓜均為中長棒狀，蔬研十二號和上栗白黃瓜為黃綠色。聚類分析與性狀特征分類基本符合，與前人[3-4]結論有一定的相似之處，可以作為依據進一步明確煙臺地區現有黃瓜品種間的親緣關系。

筆者的研究為煙臺地區黃瓜的種質資源鑒定與保護、育種親本選育提供了理論和技術支撐，對于保障黃瓜種質市場良好發展以及彌補煙臺地區黃瓜的種質資源研究、利用和評價方法欠缺，為實現種質創新和推動黃瓜育種進程具有重要意義。但有關SSR 分子標記后續應開發篩選更多的引物，增加選用的種質數量，進一步推動種質資源的研究利用。