高溫脅迫下外源褪黑素對膠州大白菜幼苗生理特性的影響

周海月，劉維信，陳 熙，倪潤茂，趙紫彤

（青島農業大學園藝學院 山東青島 266109）

大白菜（Brassica campestrisL.ssp.pekinensis）喜低溫冷涼環境，幼苗期適宜溫度為20～25 ℃，因此多在秋季氣溫偏涼時種植。膠州大白菜原產于山東省青島市膠州市，具有味美鮮甜、營養豐富的特點，是全國農產品地理標志產品，更是青島特產，栽培面積約4000 hm2。然而在實際生產中，秋后內陸極端高溫會使膠州大白菜出現出苗受阻，葉片萎蔫、發黃甚至枯萎的現象，制約膠州大白菜生長，嚴重影響其產量及商品性。

褪黑素（melatonin，MT）被認為是潛在參與調控種子萌發的一種植物激素[1]。近些年研究發現MT 廣泛存在于高等植物體內，目前在蔥科、鳳梨科、天南星科、十字花科等100 多種植物中均已發現MT 的存在[2]，褪黑素對植物的各種生理活動起重要作用，尤其是可以緩解各種逆境對植物的損傷[3]。噴施MT 能顯著提高小白菜抗氧化物酶的活性[4]，間接增加抗氧化物質的含量，提高西瓜嫁接苗的低溫抗性[5]；MT 還能高效清除自由基從而增強黃瓜的耐冷性[6]和耐熱性[7-8]，提高玉米抗鹽脅迫能力[9]，緩解干旱脅迫對小麥幼苗的細胞膜造成的損害[10]。但目前關于MT 緩解大白菜幼苗高溫脅迫下的生理機制尚不清晰。

筆者利用不同濃度外源MT 處理膠州大白菜幼苗，并與脅迫對照相比，研究高溫脅迫下膠州大白菜的各項生理指標變化，揭示外源MT 緩解膠州大白菜高溫脅迫的作用機制，為膠州大白菜抵抗高溫逆境方面的研究和實際生產中的應用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的膠州大白菜商品種為秋季王，購于膠州市東茂蔬菜研究所。褪黑素購于麥克林公司（上海）。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法 試驗于2022 年9－12 月在青島農業大學科技樓進行。大白菜種子消毒后進行催芽，萌發的種子直接播種到50 孔穴盤進行培苗，待幼苗長到2 葉1 心時選取長勢一致的幼苗移栽到直徑10 cm 的圓形花盆中，基質加水混勻至成團不滴水的狀態裝盆，每盆1 棵，放入實驗室恒溫培養箱進行后續的脅迫處理。每個處理20 盆幼苗。光周期12 h（晝）/12 h（夜）、晝夜溫度（28±1）℃/（17±1）℃。待植株子葉展平生長到5 周齡后選擇整齊一致的壯苗，進行噴施外源MT 處理，設置6 個處理濃度，分別為0（CK）、10、50、100、200 和500 μmol·L-1，于夜間避光噴施，以葉片滴水為度，噴布幼苗葉片，一共噴施3 次，每次間隔24 h，最后一次噴施MT 1 d 后將幼苗進行高溫處理，培養箱參數設定為：光周期12 h（晝）/12 h（夜），光照度1000 μmol·m-2·s-1，相對濕度75%，晝夜溫度（39±1）℃/（27±1）℃。

1.2.2 生長指標的測定 高溫脅迫11 d 后進行生長指標的測定，用直尺測定幼苗的株高、葉長、根長，用游標卡尺測定莖粗。將幼苗清理干凈后稱鮮質量，烘干至恒質量后分別測定地上部和地下部干質量。

1.2.3 生理指標的測定 分別在脅迫的第1、3、5、7、9、11 天，選取各處理長勢均勻一致的植株，取其第4 片真葉用于各生理指標的測定。參考高俊鳳[11]的方法測定相對含水量、相對電導率和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，采用氮藍四唑法（NBT）測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（CAT）活性，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量。參考Heath[12]的方法測定葉綠素總含量和葉綠素a 含量；采用TAD 法測定丙二醛（MDA）含量[13]。上述指標均重復測定3 次，以平均值作為各處理的實測值。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 整理所得數據并繪制表格和柱形圖，采用IBM SPSS Statistics 26 進行方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度外源MT 處理對膠州大白菜形態指標的影響

2.1.1 不同濃度外源MT 處理對膠州大白菜生長發育特性的影響 由圖1 可以看出，高溫脅迫處理前3 d 大白菜葉片幾乎無變化，在高溫脅迫第5天時CK 和500 μmol·L-1MT 處理組葉片出現萎蔫現象；脅迫第7 天時CK 和500 μmol·L-1MT 處理組葉片大部分萎蔫，10 μmol·L-1MT 處理組部分葉片萎蔫；脅迫第9 天時200 μmol·L-1MT 處理組葉片出現萎蔫；脅迫第11 天時CK 和500 μmol·L-1MT處理組出現植株死亡情況，10 μmol·L-1MT 處理組葉片出現發黃、失綠、大面積萎蔫的現象，且無 法 恢 復，50 和200 μmol·L-1MT 處 理組有部分葉片萎蔫，100 μmol·L-1MT 處理組表現正常。由表1 可以看出，噴施MT 能顯著提高高溫脅迫下大白菜的各項生長指標（除地下部干質量和500 μmol·L-1MT 處 理 的 莖 粗），且 隨 噴 施 濃 度的增加總體上呈先上升再下降的趨勢，其中噴施100 μmol·L-1MT 處理的株高、葉長、根長、莖粗、鮮質量、總干質量、地上部干質量和地下部干質量最高，分別比CK 顯著增加36.17%、46.31%、151.42%、73.31%、115.14%、78.87%、77.41%、192.62%。

圖1 高溫脅迫下不同濃度外源MT 處理11 d 內大白菜幼苗形態的變化Fig 1 Changes in the morphology of Chinese cabbage seedlings under high temperature stress with different concentrations of exogenous MT treatments within 11 d

2.1.2 高溫脅迫下MT 處理對苗期膠州大白菜葉片葉綠素含量的影響 由圖2 可以看出，除第1 天和第7 天500 μmol·L-1MT 處理外，高溫脅迫下所有噴施MT 處理的總葉綠素和葉綠素a 含量均高于CK。CK 和500 μmol·L-1MT 處理的總葉綠素和葉綠素a 含量在11 d 內持續下降，而10、50、100、200 μmol·L-1MT 處理的總葉綠素和葉綠素a 含量隨脅迫時間增加呈先上升后下降的變化趨勢，各處理的總葉綠素和葉綠素a 含量在第5 天達到最高，其中50、100、200 μmol·L-1MT 處理的總葉綠素和葉綠素a 含量（第1 天除外）在高溫脅迫時均高于CK，脅迫第11 天時分別比CK 顯著增加56.63%、63.02%、27.67%和69.04%、87.66%、57.12%。

圖2 高溫脅迫下外源MT 對大白菜葉片葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of exogenous MT on chlorophyll content of Chinese cabbage leaves under high temperature stress

2.2 外源MT 對高溫脅迫下大白菜幼苗生理特性的影響

2.2.1 外源MT 對高溫脅迫下大白菜幼苗滲透調節系統的影響 由圖3-A 可以看出，隨脅迫時間增加，葉片可溶性蛋白質含量呈先上升后下降的變化趨勢，第5 天時所有處理的可溶性蛋白質含量均達到最高，噴施外源MT 的各處理降幅整體均小于CK，其中100 μmol·L-1MT 處理的可溶性蛋白質含量（除第1 天外）均高于其他處理，在高溫第5 天和第11 天時100 μmol·L-1MT 處理分別比CK 顯著提高62.52%和119.34%。

圖3 高溫脅迫下外源MT 對大白菜葉片滲透調節系統的影響Fig.3 Effects of exogenous MT on the osmoregulatory system of Chinese cabbage leaves under high temperature stress

由圖3-B 可以看出，除100 μmol·L-1MT 處理外，其他處理隨脅迫時間增加葉片相對含水量呈持續下降趨勢，噴施外源MT 各處理組的相對含水量降幅均小于CK，其中100 μmol·L-1MT 處理的葉片相對含水量在高溫11 d 內下降10.86%，降幅低于其他處理，在脅迫第11 天時100 μmol·L-1MT 處理葉片相對含水量比CK 顯著高54.21%。

由圖3-C 可以看出，隨脅迫時間增加，葉片相對電導率呈持續上升的趨勢，噴施外源MT 各處理組的相對電導率增幅均小于CK，100 μmol·L-1MT處理的葉片相對電導率在高溫11 d 內上升27.68%，增幅均低于其他處理，在脅迫第11 天時100 μmol·L-1MT 處理比CK 顯著低30.40%。

2.2.2 外源MT 處理對膠州大白菜抗氧化酶活性的影響 由圖4 可以看出，隨脅迫時間增加，抗氧化酶活性大致呈現先上升后下降的變化趨勢（除CK、200 μmol·L-1和500 μmol·L-1MT 處理組的APX 活性），APX、SOD 和CAT 活性在第5 天達到最高，POD 活性在第3 天達到最高。外源MT 處理組的SOD 和CAT 活性在脅迫第3 天后均高于CK，APX 活性在脅迫第5 天后高于CK，10、100、200 μmol·L-1MT 處理組的POD 活性在脅迫第3 天后均高于CK。100 μmol·L-1MT 處理的膠州大白菜幼苗的SOD 和POD 活性在脅迫第3 天后顯著高于CK 和其他處理組。在脅迫第11 天時，100 μmol·L-1MT 處理組的APX、SOD、CAT、POD 活性分別比CK 顯著提高105.04%、93.96%、153.48% 和294.21%。

2.2.3 外源MT處理對大白菜MDA含量的影響由圖5 可以看出，隨脅迫時間的增加，葉片MDA 含量整體呈先上升后下降的變化趨勢，除第1 天外，噴施MT 處理的葉片MDA 含量在整個脅迫時間內均顯著低于CK。100 μmol·L-1MT 處理的MDA 含量在第3 天增幅最小，整個脅迫期間（除第1 天外）都顯著低于其他處理，第11 天時葉片MDA 含量比CK 顯著降低55.15%。

圖5 高溫脅迫下外源MT 對大白菜葉片MDA 含量的影響Fig.5 Effect of exogenous MT on MDA content of Chinese cabbage leaves under high temperature stress

3 討論與結論

葉綠素是高等植物和所有其他能進行光合作用的生物體中所特有的一類能吸收傳遞光能和參與光化學反應的光合綠色色素。植物葉綠素含量與其對環境的適應性有關，研究表明，大部分葉綠素a 和全部葉綠素b 是主要參與吸收和傳遞光能的光合色素，葉綠素a 更是作物光合作用的主要組分，可以反映作物對長波光的吸收程度[12]。

可溶性蛋白質是重要的滲透調節物質和營養物質，它的增加和積累能提高細胞的保水能力，保護生物膜及細胞的生命物質免受脅迫傷害[13]。MT通過增加可溶性蛋白質的含量，提高玉米[9]]、甜瓜[13抗鹽脅迫的能力，增強菊花幼苗耐熱性[14]。

前人研究表明，外源MT 處理能夠提高高溫脅迫下甘藍[15]、黃瓜[7-8]中APX、SOD、CAT 和POD 的活性；研究發現，外源MT 處理能夠降低鹽脅迫下玉米[9]、干旱脅迫下油菜[16]和冷脅迫下黃瓜[17]中MDA 的含量。

本試驗結果表明，高溫脅迫導致膠州大白菜幼苗葉片葉綠素含量明顯下降，但噴施MT 能在短時間內顯著提高總葉綠素含量和葉綠素a 含量，以100 μmol·L-1MT 處理效果最佳，說明外源MT 處理可以增強膠州大白菜幼苗葉片光合色素的穩定性，與在小麥[10]、小白菜幼苗[18]、甜瓜[19]上的研究結果一致。這可能與MT 可以調節光合色素合成和轉運相關基因的表達、提高葉綠素合成過程中的酶活性有關[10]。本試驗結果表明，隨脅迫時間增加膠州大白菜葉片可溶性蛋白質含量呈先上升后下降的趨勢，噴施不同濃度MT 在一定程度上提高了葉片可溶性蛋白質含量，這可能是因為MT 會調節植物的蛋白質代謝，從而影響可溶性蛋白質的合成。100 μmol·L-1MT 處理的膠州大白菜葉片可溶性蛋白質含量最高，對高溫脅迫的緩解效果最好。相對電導率反映細胞膜損壞程度，可以通過這一重要指標鑒定植物高溫抗性能力的強弱[20]。高溫導致植物的水分蒸發速率加快，引起植物體內的電解質紊亂，加劇植物葉片水分流失，從而造成葉片萎蔫[21]，嚴重時會使其死亡。高溫脅迫下膠州大白菜葉片相對含水量逐漸降低，葉片相對電導率逐漸升高，說明高溫破環了細胞膜的完整性，導致膜透性增強。噴施MT 可有效緩解高溫脅迫對大白菜細胞膜系統的損傷，減少細胞膜的破裂和細胞質胞液外滲，100 μmol·L-1MT 處理表現最好，這與前人在油菜幼苗上的研究結果一致[21]。本試驗結果表明，隨脅迫時間延長，APX、SOD、CAT、POD 活性和MDA 含量呈現先上升后下降的趨勢，APX、SOD、CAT 活性在高溫脅迫下前5 d 逐漸上升之后第7 天開始下降；POD 活性在高溫脅迫下前3 d 上升后第5 天迅速下降，MDA 含量先上升后緩慢下降。然而，高溫脅迫第3 天開始，外源MT 處理組的SOD和CAT 活性均高于CK，10、100、200 μmol·L-1MT處理組的POD 活性高于CK；MDA 含量均顯著低于CK。噴施100 μmol·L-1MT 的膠州大白菜幼苗APX 活性在第5 天顯著高于其他處理組，自脅迫第3 天開始，100 μmol·L-1MT 處理組的SOD、CAT（除第7 天）和POD 活性最高，MDA 含量最低。抗氧化酶活性的變化，表明外源MT 可以通過調節植物的抗氧化系統，降低高溫脅迫對植物的氧化損傷，從而增強大白菜的耐熱性。MDA 含量下降也許是因為抗氧化酶APX、SOD、POD 和CAT 活性的提高，清除了自由基。以上結果說明，外源MT 通過調節植物的MDA 含量減輕氧化應激作用，降低了高溫對膠州大白菜的損傷程度。

綜上所述，與對照相比，噴施不同濃度的外源MT，能夠提高膠州大白菜幼苗的生物量、葉綠素含量、可溶性蛋白質含量和多種抗氧化酶（APX、SOD、CAT）活性，減緩了相對含水量下降和相對電導率提升，并且顯著降低了除脅迫第1 天外的MDA 含量。同時，不同濃度MT 噴施的效果也存在差異，濃度為100 μmol·L-1的外源MT 噴施葉面效果最佳。