不同辣椒栽培種的雜交親和性比較及胚胎拯救體系建立

施二榮，胡能兵，隋益虎，袁友志，來喜月，王 勃

（1.安徽科技學院農學院 安徽鳳陽 233100；2.安徽金泰種業有限公司 合肥 230031）

辣椒（Capsicum）為茄科辣椒屬一年生草本植物[1]。目前，全球共有5 個辣椒栽培種（Capsicum annuumL.、Capsicum chinenseL.、Capsicum frutescensL.、CapsicumpubescensL.、CapsicumbaccatumL.）和20 多個野生種[2]，其中我國種植面積最大的是C.annuum，該栽培種具有產量高、適應性強等特點，但抗性差異較大；C.frutescens和C.chinense兼具辣度高、抗性強等特點，但其栽培條件受區域限制較大且產量很低。有研究表明，各辣椒栽培種種間雜交均存在不同程度的生殖障礙[3-4]。

種間雜交是拓寬辣椒栽培種遺傳基礎和創制種質資源的有效方式[5-6]。為了能有效創制新的辣椒種質資源，聚合更多的有益性狀，前人結合胚胎拯救技術導入外源基因，拓寬主要栽培種的遺傳背景。Sui 等[7]通過C.annuum7033×C.chinense7020獲得F1雜種，并自交獲得大量分離后代；Yoon 等[8]將炭疽病抗性從C.baccatum滲入到C.annuum，在C.annuum回交后代中篩選出了大量高抗炭疽病的改良植株。

近年來高辣、高抗已成為辣椒育種的重要方向之一[9]。辣度較高、抗逆性較強的C.chinense、C.frutescens由于產量低而在我國栽培面積始終較小。為了把高辣度、強抗逆和高產量相結合，筆者利用3 個栽培種辣椒進行遠緣雜交，通過對雜交坐果率、胚萌發率、拯救時期以及F1幼胚生根效果等指標的觀測，旨在建立一套系統的胚胎拯救技術體系，提高遠緣雜交的成功率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料包含3 個辣椒栽培種（圖1），即8 份C.annuumL.、8 份C.chinenseL.和1 份C.frutescensL.共17 份試驗材料（表1），均來自于安徽科技學院辣椒種質資源庫，于2022 年3 月種植于安徽科技學院種植科技園3 號溫室，四周覆蓋30 目防蟲網，栽培期間進行正常的生產管理。

表1 用于遠緣雜交的辣椒親本信息Table 1 Capsicum parental information for distant hybridization

圖1 3 個辣椒栽培種的典型圖片Fig.1 Typical pictures of three Capsicum species

1.2 方法

1.2.1 種間雜交 不同辣椒材料進入盛花期后選配了18 對正反交組合（表2）。雜交授粉時選擇適齡花蕾徒手去雄，授粉在晴天07：00 至10：30、15：30 至18：00 進行，授粉后掛牌標記，第2 天重復授粉1 次，授粉后14 d 統計坐果率。

表2 3 個栽培種辣椒種間雜交的正反交組合Table 2 Reciprocal interspecific hybridization combinations of Capsicum species

1.2.2 消毒及拯救（萌發）培養基篩選 授粉后第34 d，選取Ca4×Cc5 未成熟的F1幼胚在無菌組培室的潔凈操作臺上進行消毒處理，流水沖洗表面灰塵后用75% 的酒精進行果實表面消毒1 min，剖開果實內腔胎座及幼胚消毒30 s，再用0.1% 的氯化汞浸泡3 min，無菌水清洗3～5 次。將剝離的幼胚分別接種到MF0（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂，pH 6.0）、MF1、MF2、MF3、MF4、MF5、MF6培養基上（表3），從而篩出最優萌發培養基。每個處理6 次重復，每瓶接種5 個幼胚，置于（25±1）℃條件下培養，光照度為2500 lx，光周期為12 h/12 h（光照/黑暗），接種30 d 后統計胚萌發率。

表3 胚胎萌發及幼苗生根培養基Table 3 The medium of embryonic germination and seedling rooting

1.2.3 不同胚拯救時期篩選 試驗設置了5 個處理時期，即在授粉后30、32、34、36、38 d 時剪下幼果，放入篩選出的最佳培養基中進行胚胎拯救。具體操作為：在對應時間分別從每個雜交組合植株上取2 個青果，取出內部全部F1幼胚，消毒及培養條件同1.2.2，每個處理均接種3 瓶，每瓶2～9 個幼胚（視果實內幼胚多少而定）。培養30 d 后統計胚萌發率。

1.2.4 生根培養基篩選 試驗共設10 個處理組合，以不加激素的SG0（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂，pH 6.0）為對照，用萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸（IAA）3 種生長類激素各3 個濃度水平進行搭配（表3）。將拯救成功的高2～4 cm 的Ca4×Cc5 幼苗轉接至SG 培養基中，培養條件同1.2.2。每個處理設置4 次重復，每次重復接種3 株幼苗，接種30 d 后統計生根莖段數、生根率、每莖段生根數及平均根長。

1.3 指標測定

1.3.1 坐果指標測定 授粉后記錄各組合授粉總花數，于第14 天調查坐果情況，計算坐果率。

1.3.2 胚萌發指標測定 將幼胚接入培養基后，于第30 天觀察幼胚的萌發情況，統計萌發幼胚數，幼胚萌發以長出子葉為標準。

1.3.3 根系各指標測定 將莖段接入不同的SG 培養基后，于第30 天對各處理的生根數、生根率、平均每莖段生根數、平均根長進行統計分析。

1.4 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2016 進行數據處理和圖表制作，采用DPS7.05 進行完全隨機單因素試驗方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同種間雜交組合的坐果率與種子數統計

由表4 可知，18 個正反交組合，共授粉花數1451 朵，平均坐果率總體較低，僅為7.58%，平均每果種子數為14.82 粒。但不同栽培種做母本時，坐果數（坐果率）存在差異。C.annuum做母本時共授粉899 朵花，坐果數為72 個，平均坐果率為8.01%，共獲得種子1336 粒，平均每果種子數18.56 粒；C.chinense為母本時共授粉520 朵花，坐果數為28個，平均坐果率為5.38%，共獲得種子223 粒，平均每果種子數7.96 粒；C.frutescens做母本時，共授粉32 朵花，坐果數為10 個，坐果率31.25%，獲得種子數為71 粒，平均每果種子數7.10 粒。3 個栽培種分別做母本時，C.frutescens的坐果率最高，但其產生的種子數最少；C.annuum做母本時坐果率次之，其產生種子數最多；C.chinense做母本時，坐果率最低，所產生的種子數介于C.frutescens和C.annuum之間。

表4 正反交授粉及坐果統計Table 4 Pollination and fruit-setting of reciprocal interspecific

同時，不同的雜交組合，正反交坐果率也不同。雜交組合Ca1×Cc3、Ca2×Cc1 正交時均能產生雜交果實，坐果率分別為18.18%、14.29%，反交時無果實產生；Ca8×Cc6、Cc7×Cf1、Ca7×Cc4 正交時均無果實，反交則有果實，坐果率分別為32.50%、31.25%、11.54%。Ca6×Cc2、Ca4×Cc5、Ca3×Cc8、Ca5×Cc2 正反交時均有少數雜交果實產生，正交坐果率為3.13%～11.57%，反交坐果率為1.67%～5.00%。

2.2 胚胎拯救的萌發培養基篩選

將Ca4×Cc5 授粉后34 d 的幼胚分別接種于7種培養基上，結果如表5 所示，幼胚在MF0、MF1、MF2及MF4上萌發率相同，MF5次之，MF6的胚發育率較低，MF3胚萌發率為0，推測可能是激素濃度過高，抑制了胚的萌發。因此，從試驗成本方面考慮，選擇MF0作為最適合幼胚萌發的培養基，即不需要添加激素，胚胎拯救在MF0培養基上萌發情況見圖2。

表5 培養基對辣椒幼胚胚胎拯救的影響Table 5 Effect of culture medium on embryo rescue of Capsicum

圖2 不同發育時期的辣椒胚胎拯救Fig.2 Embryo germination and plantlet growth in different development stages

2.3 辣椒不同胚齡對胚胎拯救的影響

由于該部分試驗對果實數量有要求，故選擇了果實數量大于等于10（每個拯救時期需要2 個青果）的5 個雜交組合進行試驗。由表6 可知，除Ca6×Cc2 組合外，其他4 個組合胚的萌發率在胚胎拯救期間隨時間的延長均呈先上升后下降的趨勢，34 d 的幼胚萌發率最高，為45.45%，38 d 有3 個雜交組合的幼胚萌發率為0，其原因可能為取材時間過晚，胚已死亡。在Ca1×Cc3、Ca6×Cc2、Cc6×Ca8、Ca4×Cc5 雜交組合中，34 d 胚齡的胚萌發率均最高，分別為31.58%、34.62%、45.45%、36.00%，僅在Cf1×Cc7 雜交組合中，34 d 胚齡的幼胚萌發率比32 d 胚齡低20.83%。可見，C.annuum或C.chinense做母本時，34 d 胚齡的幼胚最適合于拯救；而當C.frutescens做母本時，32 d 胚齡的幼胚最適合拯救。雜交組合Cf1×Cc7 整個幼胚拯救期間的胚平均萌發率最低，為11.43%，不同栽培種做母本時，其胚的萌發率有所不同。

表6 不同胚齡對辣椒胚胎拯救的影響Table 6 Effects of different embryo ages on embryo rescue of Capsicum

2.4 生根培養基篩選

由表7 可知，以SG0為基本培養基，添加3 個不同種類3 種不同濃度的生長類激素的培養基，其生根效果均存在差異。生根莖段數、生根率、平均每莖段生根數和平均根長均以SG3表現最優，平均每莖段生根數和平均根長顯著高于其他處理。由圖3可知，添加相同濃度不同種類的激素誘導的根形態也存在差異。添加0.5 mg·L-1NAA 的SG3表現為根多且粗壯，添加0.5 mg·L-1IBA 的SG6根較細且生根率低，添加0.5 mg·L-1IAA 的SG9表現為根少且長短不均，以MS 為培養基時，SG0表現為根少且細長。綜上所述，添加0.5 mg·L-1NAA 的SG3培養基為辣椒組培苗生根最理想的培養基。

表7 不同濃度激素對辣椒組培苗生根影響Table 7 Effects of different concentrations of hormones on rooting of Capsicum tissue culture seedlings

3 討論與結論

胚敗育是辣椒種間雜交的一個共同特征[10]。在多數遠緣雜交中，通常會收獲到癟的或退化的種子，這一現象被認為是受精后發育障礙導致的[11]。Martins 等[4]從C.annuum×C.baccatum組合中得到了9 粒種子，但有7 粒沒有發育成完整植株；Yoon等[12]觀察到C.annuum×C.baccatum雜交后胚敗育發生在授粉后15 d，另一個現象是種子在成熟前便開始干燥失去活力。筆者試驗中的18 對雜交組合，部分授粉后不能坐果，故無法對其進行胚胎拯救。另一部分授粉后可坐果，但因不同栽培種間親緣關系較遠，且存在雜交障礙，為防止果實內部幼胚在發育后期死亡而無法獲得雜種植株，故選擇在特定時間對其進行胚胎拯救。此外，筆者還觀察到多數辣椒材料雜交后只有微小的種皮，部分種子中途褐化失去活力或沒有種子，但果實仍能正常生長。Pickersgill[13]認為，受精后胚敗育的合子障礙問題可以通過植物組織培養，特別是胚胎拯救技術來解決。

基因型不同，種間雜交、胚胎拯救技術難易程度不同。程志芳等[14]采用常規授粉技術對5 個辣椒栽培品種進行了種間正反交，僅從一小部分的辣椒雜交組合中獲得了雜種植株。筆者的研究中總體種間雜交平均坐果率低，但不同栽培種做母本時仍有相對較大的差異。C.annuum為母本時，坐果率為0～18.18%，平均每果種子數為0～20.84 粒；C.chinense為母本時，坐果率為0～32.50%，平均每果種子數0～9.92 粒；C.frutescens為母本時，坐果率為31.25%，平均每果種子數7.10 粒。試驗中正反交結實率差異較大，可見坐果率、果實內種子數與父母本的基因型有關。此外，筆者的試驗在溫度較高的溫室內進行，推測高溫可能會影響父本的花粉活力。

胚萌發是胚拯救的關鍵環節。培養基成分對幼胚萌發和存活有直接影響。據報道6-BA、NAA、GA3、ZT、IAA 對不同作物的幼胚萌發具有促進作用[15-18]，在辣椒胚胎拯救中常用的激素有IAA、GA3

[13，19]。但筆者研究發現不添加任何激素的MF0與添加IAA、6-BA 的處理無顯著差異，推測該階段導致幼胚敗育的關鍵是營養虧缺，而不是激素水平的高低。

適宜的胚齡是胚胎拯救成功與否的最重要的影響因子之一。一般情況下，在雜種胚敗育之前將胚取出進行離體培養可避免胚的早衰，而胚發育的越完全，拯救的成功率越高[20]。筆者的試驗以30～38 d 胚齡的幼胚進行離體培養，其中C.annuum×C.chinense、C.chinense×C.annuum的雜交組合中34 d胚齡的胚萌發率最高，C.frutescens×C.chinense的雜交組合中32 d 的胚萌發率最高，而38 d 的胚萌發率普遍較低，主要表現為幼胚褐化，其主要原因推測為不同栽培種種間的雜交果實熟性有差異，導致酚類物質積累不同，故胚胎拯救效果不佳。因此，針對不同的辣椒栽培種，仍需要探究適合幼胚培養的最佳胚齡。

綜上所述，試驗中不同辣椒栽培種正反交組合坐果率整體較低但仍有差異。最佳胚萌發培養基選擇低成本的MF0（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂，pH 6.0），胚平均萌發率可達到20%。胚拯救適宜的取材時期應在授粉后32～34 d，此時胚拯救成功率最高。生根培養基應選擇SG3（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂＋0.5 mg·L-1NAA，pH 6.0）。該體系適合本試驗中3 個栽培種種間雜交幼胚的培養，研究結果為加快辣椒新品種選育進程奠定了基礎。