高產β-葡聚糖酶木霉菌誘變育種及對黃瓜枯萎病的生防效果

楊春林，李洪浩，胡 強，席亞東

（1.蔬菜品種改良與種質創新四川省重點實驗室·四川省農業科學院植物保護研究所 成都 610066；2.四川省樂山市植保植檢站 四川樂山 614000；3.竹類病蟲防控與資源開發四川省重點實驗室·樂山師范學院 四川樂山 614000）

β-葡聚糖屬于非淀粉性多糖，是葡萄糖以β-1，3和β-1，4 糖苷鍵連接而成的D 型葡萄糖聚合物[1]。β-葡聚糖除了在植物細胞壁中少量存在外，還是絕大多數病原真菌細胞壁的主要骨架結構成分[2]。β-葡聚糖酶屬于水解酶類，廣泛存在于細菌、真菌、植物和昆蟲中，因來源和序列進化關系的差異，其結構和催化功能呈現多樣性，目前關于具有應用潛力的不同來源的β-葡聚糖酶的報道很多[3]。外源β-葡聚糖酶通過催化葡聚糖多聚體的水解而抑制病原真菌的生長及增殖[4]，在環境污染和農產品質量安全問題日益突出的今天，作為具有生防功能的生物酶類，β-葡聚糖酶在植物真菌病害防治方面具有很大的研究應用價值。

獲得β-葡聚糖酶的途徑主要有兩種，一種是從動植物體內分離提取[5-6]，另一種則是通過微生物發酵。目前報道產β-葡聚糖酶的微生物主要有芽孢桿菌[7-8]、鐮刀菌[9]、曲霉菌[10-11]、木霉菌等[12-13]。其中，木霉菌因同時具有空間占位、降解病原菌細胞壁及誘導植物產生防御抗性等多種生防機制，是重要的植物病害生物防治菌[14-16]。由于篩選技術等方面的局限，野生菌株的產酶能力比較低，往往采取人工育種的方式對菌株進行改良[17-19]以獲得理想菌株。誘變育種通過誘變劑處理提高菌種的突變概率和變異幅度，從而選出具有優良特性的變異菌株[20]。四川省農業科學院植物保護研究所生防實驗室以往的研究表明，哈茨木霉菌株Th-30 對多種蔬菜作物具有防病促生效果[21-22]。筆者采用紫外線照射與亞硝基胍處理相結合的方法對哈茨木霉菌株Th-30進行誘變，選育β-葡聚糖酶高產突變菌株，提高其生防潛力，并評價突變木霉菌株β-葡聚糖酶誘導發酵液對黃瓜枯萎病的防治效果，以期為黃瓜枯萎病生物防治提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

哈茨木霉菌Trichoderma harzianumTh-30、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum由四川省農業科學院植物保護研究所生防實驗室保存；3%氨基寡糖素由河北嘉和生物科技有限公司生產；2%春雷霉素由江西省贛州宇田化工有限公司生產；β-葡聚糖、葡萄糖標準品由德國Sigma 公司生產；其他試劑均為國產分析純。

1.2 試劑及培養基制備

1.2.1 試劑配制DNS 試劑 3，5-二硝基水楊酸3.15 g、酒石酸鉀鈉91 g、NaOH 20 g、無水亞硫酸鈉2.5 g、苯酚2.5 g、ddH2O 1000 mL；亞硝基胍（NTG）溶液：NTG 結晶10 mg、助溶劑甲酸銨0.05 mL、pH 6 磷酸鹽緩沖液配成4000 μg·mL-1原液。

1.2.2 培養基制備 初篩培養基（1 L）：l g·L-1β-葡 聚 糖、3 g·L-1NaNO3、0.6 g·L-1去氧膽酸鈉、1 g·L-1K2HPO4、0.01 g·L-1FeSO4·7H2O、0.5 g·L-1MgSO4·7H2O、0.5 g·L-1KCl、18 g·L-1瓊脂，4 g·L-1的剛果紅溶液3 mL。葡聚糖誘導培養基：1 g·L-1β-葡聚糖、5 g·L-1蛋白胨、10 g·L-1燕麥粉、1 g·L-1KH2PO4、0.1 g·L-1CuSO4·5H2O、0.1 g·L-1CaCl2·2H2O、0.08 g·L-1MnCl2·4H2O、0.1 g·L-1MgSO4·7H2O、0.07 g·L-1ZnSO4·7H2O、0.05 g·L-1CoCl2·6H2O、0.01 g·L-1FeSO4·7H2O。

1.3 木霉菌的復合誘變育種

1.3.1 單孢子懸液的制備 誘變試驗于2021 年7－11 月在四川省農業科學院植物保護研究所病害實驗室進行。取斜面保存的木霉菌種，于30 ℃條件下活化培養，用無菌生理鹽水沖洗孢子制成懸液，倒入無菌三角瓶中，塞緊棉塞并用無菌牛皮紙包扎瓶口，充分振蕩形成單孢子懸液，用滅菌的脫脂棉過濾，血球計數板計數，調整孢子濃度為106CFU·mL-1。

1.3.2 紫外誘變 移取單孢子懸液5 mL 加至無菌培養皿，放入無菌磁力攪拌子，用黑紙包住后置于磁力攪拌器上，距15 W 紫外燈30 cm 處誘變5～45 min。移取經紫外線照射的孢子懸液，將孢子濃度調整為104CFU·mL-1，取0.1 mL 孢子懸液涂布于初篩培養基上，用黑紙包住于30 ℃培養72 h 后統計菌落數，計算致死率。從致死率為70%～80%的平板中挑取生長旺盛、透明圈大的菌落，接種于剛果紅鑒定平板上，于28 ℃恒溫培養48 h，連續轉接3 次，觀察記錄菌落生長和透明圈產生情況。選取透明圈直徑/菌落直徑較大的菌株，培養至對數生長期后按1.3.1 的方法制成單孢子懸液進行下一步試驗。

1.3.3 亞硝基胍誘變 將5 mL 單孢子懸液、1 mL NTG 溶液加入離心管中，充分混勻，28 ℃水浴振蕩5～45 min，離心后去上清液，用無菌水洗滌菌體3～5 次以終止NTG 的誘變作用；加入5 mL 無菌生理鹽水，充分搖勻，取0.1 mL 孢子懸液涂布于初篩培養基上，于28 ℃黑暗培養72 h 后統計菌落數，并計算致死率。從致死率70%～80%的平板中挑取菌落進行培養，觀察記錄菌落生長和透明圈產生情況，選取透明圈直徑/菌落直徑較大的菌株保存備用。

1.3.4 突變菌株β-葡聚糖酶粗酶液的制備 將突變菌株在PDA 培養基上活化培養至產生大量綠色分生孢子，用5 mL 無菌水沖洗并收集分生孢子液，將孢子濃度調整到106CFU·mL-1后接種到葡聚糖誘導培養基上，于28 ℃、150 r·min-1振蕩培養64 h，得到木霉β-葡聚糖酶誘導發酵液。將發酵液于4 ℃、5000 r·min-1離心10 min，取上清液。在上清液中加入分散的硫酸銨，攪拌均勻后于室溫靜置過夜，將鹽析液于4 ℃、8000 r·min-1離心20 min，去上清液，加入5 mL 磷酸鹽緩沖液充分溶解，若出現渾濁現象則再次離心10 min；將上清液用0.20 μm 微孔濾膜過濾，除去分生孢子即得β-葡聚糖酶粗酶液，于4 ℃保存備用。

1.3.5β-葡聚糖酶活性測定 采用還原糖法（DNS法）測定突變菌株的β-葡聚糖酶粗提液活性，以1 mL 粗酶液1 分鐘水解葡聚糖產生1 μmol 還原糖所需的β-葡聚糖酶量為1 個酶活性單位（U）。

1.3.6 突變菌株生長速率及產孢能力測定 將突變菌株于20 ℃活化培養3 d，用打孔器沿菌落邊緣截取直徑5 mm 菌塊接種于PDA 培養基上，黑暗條件下20 ℃恒溫培養2 d 和7 d 分別測量菌落直徑和產孢量。

1.3.7 突變菌株產β-葡聚糖酶的遺傳穩定性試驗 將保存的突變菌株用PDA 培養基活化培養10 d 后進行轉接培養，連續轉接至第8 代，采用DNS 法測定每代菌株產β-葡聚糖酶活性，研究其高產β-葡聚糖酶的遺傳穩定性。

1.4 不同木霉菌β-葡聚糖酶誘導發酵液對室內盆栽黃瓜枯萎病的防治效果

1.4.1 盆栽試驗設計及處理 試驗于2022 年3－4月在四川省農業科學院植物保護研究所蔬菜病害實驗室進行。黃瓜種子經5%次氯酸鈉溶液浸種10 min 后用清水沖洗，放入墊有2 層濾紙的培養皿中，置于恒溫培養箱于28 ℃催芽；胚根長約5 mm時將其播種于塑料育苗缽內，在20～25 ℃光照培養箱內育苗，每天光照12 h，育苗基質為高溫蒸汽滅菌（134 ℃，30 min）的蛭石、草炭和菜田土（體積比為1∶2∶1）。試驗設6 個處理：清水對照（CK）、UN-2β-葡聚糖酶發酵液、UN-2β-葡 聚 糖 酶 粗 酶液、Th-30β-葡聚糖酶發酵液、3%氨基寡糖素、2%春雷霉素，每個處理3 次重復，出苗后每組保留30株生長健壯一致的幼苗，隨機區組排列，常規管理，至2 片子葉展平期，將幼苗連根取出，清水沖洗根部后用106CFU·mL-1黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液沒過根部浸根5 s，重新定植于育苗缽內；間隔24 h 后，每育苗缽分別澆入200 mL 不同的處理液，15 d 后統計病情指數和防治效果。

1.4.2 盆栽病害調查 按照中華人民共和國農業行業標準（NY/T 1857.3—2010）《黃瓜主要病害抗病性鑒定技術規程第三部分：黃瓜抗枯萎病鑒定技術規程》，將黃瓜枯萎病病情級別劃分為5 個級別：0 級，無癥狀；1 級，子葉黃化，但未萎蔫；2 級，子葉萎蔫；3 級，子葉和真葉萎蔫或植株矮化；4級，枯死。病情指數＝Σ（病級數×該病級植株數）/（最大病級數×植株總株數）×100，防治效果/%＝（對照組病情指數－處理組病情指數）/對照組病情指數×100。

1.4.3 幼苗鮮質量調查 試驗結束后輕輕取出黃瓜幼苗沖洗干凈，用濾紙將水分吸干后用電子天平稱量各處理幼苗鮮質量，并計算增重率。增重率/%=（處理組幼苗鮮質量－對照組幼苗鮮質量）/對照組幼苗鮮質量×100。

1.5 突變木霉菌株UN-2對黃瓜枯萎病的大田防治效果

1.5.1 大田試驗設計及處理 試驗分別于2022 和2023 年3－6 月在四川省農業科學院現代農業科技創新示范園進行，選擇黃瓜枯萎病發病較重的連作黃瓜地進行大田防治效果試驗。黃瓜幼苗第1 片真葉出現時移栽，種植密度為3000 株·667 m-2。試驗共設4 個處理，每個處理3 次重復，共12 個小區，隨機區組排列，每個小區移栽100 株黃瓜苗。移栽5 d 后，采用灌根法施用1.3.4 制備的木霉UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液、木霉UN-2β-葡聚糖酶粗酶液，每株施用200 mL，每隔7 d 施用1 次，連續3 次，以施用3%氨基寡糖素800 倍液和清水為對照。

1.5.2 大田病害調查 第3 次施藥后10 d（幼苗期）、25 d（速長期）、40 d（開花期）、55 d（盛果期）分4 次調查各小區黃瓜枯萎病發病情況。參照張忠良等[23]的方法，將黃瓜枯萎病病情級別劃分為5 個級別：0 級，植株正常生長，不發??；1 級，植株有少于1/4 的葉片萎蔫；2 級，植株有等于或多于1/4、少于1/2 的葉片萎蔫；3 級，植株有等于或多于1/2、少于3/4 的葉片萎蔫；4 級，植株完全萎蔫死亡。病情指數和防治效果計算方法同1.4.2。

1.6 數據統計與分析

數據使用Excel 2007 軟件進行統計，DPS 9.50統計軟件進行方差分析，采用Duncan 氏新復極差法分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 復合誘變方法對木霉菌株的致死效應

由圖1～2 可知，兩種誘變方式下木霉孢子致死率在處理前期均呈快速增長趨勢，處理15 min 時致死率已超過75%，隨著誘變時間的延長，誘變處理對木霉孢子的致死率曲線趨于平緩。其中，紫外誘變15 min 對木霉孢子致死率為78.6%，亞硝基胍誘變10 min 對木霉孢子致死率為76.3%。試驗以木霉孢子致死率70%～80%的處理劑量為參考，即紫外線輻射誘變15 min 再用亞硝基胍處理10 min 作為復合誘變育種方式。

圖1 紫外誘變致死率曲線Fig.1 Mutagenic lethality curve of ultraviolet

圖2 亞硝基胍誘變致死率曲線Fig.2 Mutagenic lethality curve of NTG

2.2 高產葡聚糖酶木霉菌株的選育

通過復合誘變篩選出126 株在初篩培養基上生長旺盛且透明圈/菌落直徑比較大的突變木霉菌株。將126 株突變菌株進行β-葡聚糖酶誘導發酵試驗，DNS 法酶活測定結果表明，6 株突變木霉菌株產β-葡聚糖酶能力顯著高于親本木霉菌株Th-30，分別編號為UN-1、UN-2、UN-3、UN-4、UN-5和UN-6（表1），6 株突變菌株β-葡聚糖酶誘導發酵液酶活性為33.70～44.50 U，較親本菌株提高57.70%～108.24%；其中突變菌株UN-2 和UN-5 發酵液酶活性提高率均超100%，產酶能力顯著高于其他突變菌株。從不同菌株的生長特性來看，除了突變菌株UN-3、UN-5 的菌絲生長速率顯著低于親本菌株外，其他突變菌株生長速率與親本菌株沒有顯著差異；除了UN-4 的產孢量顯著低于親本菌株外，其他突變菌株的產孢量與親本菌株沒有顯著差異。

表1 不同菌株的β-葡聚糖酶活性及生長特性Table 1 Activity of β-Glucanase and growth characteristics of different strains

2.3 突變菌株產酶能力的遺傳穩定性

突變木霉菌株產β-葡聚糖酶的遺傳穩定性試驗結果表明（圖3），6 株突變菌株產酶能力在代次轉接前期均有不同程度下降，轉接5 代后其產β-葡聚糖酶活性基本保持穩定，說明本試驗通過復合誘變獲得的目標菌株高產β-葡聚糖酶的能力具有較好的遺傳穩定性。其中，菌株UN-2 高產β-葡聚糖酶遺傳穩定性最好，轉接8 代后產β-葡聚糖酶活性為44.1 U，與第1 代基本相當；其次是菌株UN-4，其轉接8 代后產β-葡聚糖酶活性為39.8 U；菌株UN-5 第1 代產β-葡聚糖酶活性最高，但是轉接4 代后產酶能力下降較快，轉接8 代后β-葡聚糖酶活性為38.1 U，較第1 代下降14.38%。

圖3 突變菌株產酶能力的遺傳穩定性Fig.3 Genetic stability of enzyme production ability of mutant strains

2.4 木霉菌β-葡聚糖酶誘導發酵液對室內盆栽黃瓜枯萎病的防治效果

由表2 可知，黃瓜枯萎病盆栽防治效果5 組處理病情指數為23.33～40.83，均顯著低于清水對照；UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液和UN-2β-葡聚糖酶粗酶液處理的病情指數均顯著低于Th-30β-葡聚糖酶誘導發酵液和2%春雷霉素處理。從防治效果看，3%氨基寡糖素對黃瓜枯萎病防治效果最好，達68.31%；UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液和UN-2β-葡聚糖酶粗酶液對黃瓜枯萎病防治效果分別為65.29%、63.77%，均與3%氨基寡糖素和2%春雷霉素處理差異不顯著。不同處理對黃瓜幼苗增重率差異明顯，其中木霉UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液和3%氨基寡糖素對黃瓜幼苗促生增重效果較好，增重率均超過30%。木霉UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液不論是對黃瓜枯萎病的防治效果還是黃瓜幼苗的單株增重率均高于UN-2β-葡聚糖酶粗酶液。

表2 不同木霉菌株對室內盆栽黃瓜枯萎病的防治效果Table 2 Indoor potted control effects of different Trichoderma harzianum strain on cucumber wilt disease

2.5 突變菌株UN-2對黃瓜枯萎病的大田防治效果

由表3 可知，大田防治效果試驗突變木霉菌株UN-2 對黃瓜枯萎病具有一定的防控作用。2022 年大田防治試驗數據顯示，在黃瓜幼苗期和速長期，UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液對黃瓜枯萎病的防治效果分別為62.72%、67.11%，UN-2β-葡聚糖酶粗酶液對黃瓜枯萎病的防治效果分別為61.01%、63.28%，同一生育期內2 個生防處理的防治效果均與3%氨基寡糖素差異不顯著。黃瓜開花期，UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液對黃瓜枯萎病的防治效果為66.38%，與3%氨基寡糖素處理差異不顯著，顯著高于UN-2β-葡聚糖酶粗酶液處理。黃瓜盛果期，UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液、UN-2β-葡聚糖酶粗酶液和3%氨基寡糖素的防治效果分別為65.22%、50.72%和57.24%，不同處理之間差異顯著。不同處理均在黃瓜速長期（第3 次施藥后25 d）防治效果達到最高，隨著黃瓜生育期的發展，UN-2β-葡聚糖酶粗酶液和3%氨基寡糖素對黃瓜枯萎病防治效果下降較快，UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液的防治效果下降較慢，其原因可能是發酵液中的木霉孢子在黃瓜根際土壤和植株體內定殖，代謝產物包括β-葡聚糖酶等系列生防因子可持續產生抗病作用。2023年大田試驗結果與2022 年相似，由于降雨偏少，黃瓜枯萎病田間病情指數比2022 年小，不同處理的防治效果均比2022 年有所提高，其中UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液對不同生育期黃瓜枯萎病的防 治 效 果 分 別 為68.47% 、71.63% 、70.79% 和68.65%。

表3 突變菌株UN-2 對黃瓜枯萎病的田間防治效果Table 3 Field control effect of mutant strain UN-2 on cucumber wilt disease

3 討論與結論

野生菌株改良手段主要有誘變育種、原生質體融合以及遺傳改造等[18，24]。雖然建立在現代基因操作技術基礎上的基因改造更為精確，但誘變育種往往能帶來更為復雜的連鎖反應結果并具有應用簡便、費用低、效率高等優點，是當前菌種選育最常用的方法[25]。目前，報道較多的誘變育種手段有紫外輻射誘變、亞硝基胍處理、低溫等離子體誘變或以上述兩種方法復合誘變[26-27]。本試驗采用紫外線照射與亞硝基胍處理相結合的方法，對哈茨木霉菌Th-30 進行復合誘變育種，得到6 個高產β-葡聚糖酶的突變菌株，其β-葡聚糖酶活性與親本菌株相比提高57.70%～108.24%，且高產酶能力具有遺傳穩定性，說明該方法在木霉菌株誘變育種中具有一定的適用性。

誘變育種的原理是通過物理或化學的誘導使微生物中某些基因進行重組或缺失來優化基因性狀，而這個過程往往對微生物具有一定的致死效應。在誘變育種過程中，致死率過低，不能產生足夠的變異個體，使下一步篩選工作難度增加，致死率過高則存活菌數量太低且變異菌株活力較弱，一般選取致死率為70%～80%的處理劑量作為選育高產菌株的參考劑量[28]。試驗中紫外誘變15 min、亞硝基胍誘變10 min 對應木霉孢子致死率分別為78.6%和76.3%，兩種方法復合誘變獲得的β-葡聚糖酶高產突變菌株具有遺傳穩定性，且對木霉菌株菌絲生長速率和產孢量沒有顯著影響。由于試驗室條件的限制，筆者僅從酶活性水平上考查了突變菌株產酶能力的遺傳穩定性，在短期內為研究工作的開展提供了有價值的參考，突變菌株在β-葡聚糖酶基因表達水平上的遺傳穩定性還有待在今后的研究和應用中驗證。

天然來源的β-葡聚糖酶資源豐富、性質穩定，具有特定的催化活性，在植物保護方面發揮著重要的作用[29]。葡聚糖酶能通過水解病原真菌細胞壁成分控制病害發展，其直接作用于植物細胞壁的產物低聚糖可誘導與抗病反應有關的酶類如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸-CoA 聯結酶（4CL）的合成，從而增強植物的抗病性[2]。范青等[30]探討了兩種拮抗菌葡聚糖酶的產生及抑菌的機制，李紀順等[31]通過染色體整合β-1，4-葡聚糖酶基因提高綠色木霉對小麥紋枯病的防治效果，程紅梅等[32]通過轉β-1，3-葡聚糖酶基因提高棉花對枯萎病和黃萎病的抗性。黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜?；虵usarium oxysporumf.sp.cucumerinum侵染引起的一種維管束病害[33]。黃瓜枯萎病發病率一般為20%～30%，嚴重時為80%～90%，是制約黃瓜產量及品質的重要因素[34]。目前，防控黃瓜枯萎病的方法主要以化學防治為主，也有利用木霉菌等生物制劑防控黃瓜枯萎病的研究和報道。李進一等[35]通過溫室盆栽試驗發現短密木霉菌株對黃瓜枯萎病的防治效果達90.4%；谷祖敏等[36]研究表明，木霉菌可以明顯促進黃瓜根系和植株的生長發育；王依純等[37]報道了一株擬康氏木霉菌對黃瓜枯萎病的防治效果高達81.54%，且對黃瓜幼苗有明顯的促生作用。木霉菌能產生多種降解植物病原菌細胞壁的酶類物質，其中β-葡聚糖酶是公認的影響生防菌株重寄生能力的重要因子。筆者的試驗通過誘變育種獲得的β-葡聚糖酶高產木霉菌株UN-2 發酵液處理黃瓜枯萎病的病情指數顯著低于親本菌株Th-30 處理，并對黃瓜幼苗具有明顯的促生增重作用，證實木霉菌株產β-葡聚糖酶能力的增強和生防潛力之間具有正相關性。2023 年大田試驗結果表明，突變木霉菌株UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵液對不同生育期黃瓜枯萎病的防治效果分別為68.47%、71.63%、70.79%和68.65%。

綜上所述，突變木霉菌株UN-2 產β-葡聚糖酶活性顯著提高，其β-葡聚糖酶誘導發酵液對黃瓜枯萎病具有良好的防治效果，對黃瓜幼苗具有明顯促生作用，是一種可以有效防治黃瓜枯萎病的生防資源。下一步需要優化突變菌株UN-2β-葡聚糖酶誘導發酵條件及生防制劑的生產工藝，深入探討其高效利用技術，為黃瓜枯萎病的生物防治提供重要技術支撐。