山藥炭疽病病原菌的分離鑒定及其室內毒力測定

陳 功，易思情，金晨鐘，2，郭開發，2，胡 彪，段秋媛

（1.有害生物綠色防控重點實驗室·湖南人文科技學院 湖南婁底 417000；2.婁底市農業科學研究所 湖南婁底 417000）

山藥（Dioscorea oppositaThunb.）即淮山，為薯蕷科薯蕷屬植物[1]。青樹坪淮山是國家地理標志產品，也是湖南地方特色品種，產自“全國重點鎮”湖南雙峰青樹坪鎮，具有山藥界的“丑”山藥之名，青樹坪山藥外形毛多、疙瘩多、彎曲不整齊，但口感細膩，性粉，粉中帶糯，可媲美河南鐵棍山藥。其主產區土壤有機質含量高，微量元素豐富，經國家農業農村部農產品質量監督檢驗測試中心檢測，青樹坪山藥中的硒元素含量較豐富，已經達到國家“富硒產品”要求，長久食用既可以提高身體素質，又能增強人體的免疫功能[2]。

近年來，隨著農業產業結構調整和市場需求量的不斷增加，雙峰青樹坪山藥種植面積逐年擴大，病害問題日益突出。當山藥莖葉受到炭疽病危害后，受害區域一般減產20%～30%，嚴重時在50%以上。炭疽菌屬（Colletotrichum）是一種分布范圍廣、寄主植物多、侵染能力強的真菌性病害，危害柑橘、草莓、高粱和玉米等多種農作物從而引發炭疽病，導致嚴重的經濟損失[3-4]。炭疽病病原菌的分生孢子主要通過風雨傳播，有時昆蟲也能作為傳播媒介，孢子萌發后即可從氣孔、皮孔等自然孔口入侵，也可以從傷口入侵[5]。天氣條件適宜尤其高溫高濕、種薯品質不佳、種植不合理、農業管理措施不當和農藥使用不科學等都會引起炭疽病，造成嚴重的經濟損失[6]。已有文獻報道，引起山藥炭疽病的主要病原菌有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeospori‐oides）[7-8]、薯蕷盤長孢菌（Gloeosporium pestis）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）[9]，不同地區山藥炭疽病的病原菌種類不同。筆者研究的山藥病葉源于雙峰青樹坪鎮的山藥種植基地，將采集到的山藥炭疽病病葉進行組織分離，結合致病性測定、形態學特征觀察和分子生物學分析，明確山藥炭疽病病原菌種類及篩選適合的化學藥劑，可為雙峰縣山藥炭疽病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2022 年6 月在湖南婁底市雙峰縣巡勝蔬菜種植專業合作社山藥基地采集山藥炭疽病樣品，品種為湖南地方特色品種青樹坪山藥，共采集樣品9 份。

供試殺菌劑：5%己唑醇懸浮劑（上海滬聯生物藥業（夏邑）股份有限公司）；32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑（上海滬聯生物藥業（夏邑）股份有限公司）；10%苯醚甲環唑水分散粒劑（先正達南通作物保護有限公司）；70%丙森鋅可濕性粉劑（拜耳股份公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原物的分離與純化 采用組織分離法[10]對典型的山藥炭疽病病樣進行分離純化。取典型的山藥炭疽病葉，放入超凈工作臺中，用75%乙醇擦拭干凈，待葉片自然干燥后，取病健交界部位的葉組織（大小約為5 mm×5 mm）浸泡在2%次氯酸鈉溶液中1 min，用無菌水漂洗3 次后放置在無菌濾紙上，使其干燥，然后接入PDA 平板，處理完成后放置培養箱中培養，2 d 后在WA 平板上進行單孢純化，經多次純化，將分離物接種在PDA 斜面試管中并培養一段時間后置于4 ℃冰箱保存，以備后續試驗使用。

1.2.2 病原菌形態學特征 將病原菌PDA 培養基放入恒溫培養箱中（25 ℃）培養10 d，制作臨時玻片，對菌落形態、色澤、大小、分生孢子等進行觀察拍照。在顯微鏡下參照張天宇[11]的方法觀察分生孢子和孢子梗以及產孢細胞的形態和大小特征進行分類。

1.2.3 致病性測定 選用長勢健康的山藥葉片進行田間標記，對健康山藥葉片采用孢子懸浮液進行噴霧接種完成致病性測定。在已分離純化的菌落上用滅菌的打孔器（直徑=5 mm）打取數個菌餅，將其置于PD 液體培養基中，放入恒溫搖床，誘導產孢，使用血球計數板計數7 d 后的孢子濃度，用無菌水將其調整為1×106個孢子·mL-1。將健康山藥葉片用75%酒精表面消毒后，使用無菌接種針進行劃傷處理，用噴霧壺將孢子懸浮液均勻噴灑，以不接種孢子懸浮液的健康山藥葉片作為對照，將接種后的山藥葉片用套袋保濕培養48 h，3 次重復，定期觀察病斑生長情況，拍照記錄以及測量病斑直徑，觀察是否與田間病斑一致，同時對發病部位進行組織分離，比較是否與最初分離接種的發病菌株菌落特征和分生孢子形狀相同，確認其致病性。

1.2.4 分子鑒定 取PDA 培養基上具代表性菌株的菌絲組織，研磨后用DNA 提取試劑盒，提取病原物的基因組DNA。使用引物ITS1/ITS4[12]進行PCR擴增。PCR 反應體系：總體積為50 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix（+dye）25 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、DNA 模板1 μL、ddH2O 20 μL。PCR 擴增反應程序為：94 ℃4 min、94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃40 s，30個循環，72 ℃10 min。反應完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，將PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序完的基因序列進行校正處理，然后在核酸序列數據庫Gen-Bank 當中搜索比對同源序列，對比分析代表菌株與數據庫已知的相關序列的同源百分率。代表菌株根據ITS 基因的擴增序列，然后利用MEGA 7 軟件，通過自展法（bootstrap）構建系統發育樹。

1.2.5 病原物的室內毒力測定 采用菌絲生長速率法進行室內毒力測定。供試殺菌劑有5%己唑醇懸浮劑、32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、10%苯醚甲環唑水分散粒劑。在預試驗的基礎上，分別吸取各化學藥劑滴入PDA 培養基的培養皿中（V化學藥劑：VPDA培養基=1∶9），混勻，冷卻凝固備用，每個濃度梯度3 次重復。4 種供試殺菌劑的最終質量濃度分別為32.5%苯甲嘧菌酯（650、325、162.5、81.25、40.625 mg ·L-1），5%己 唑 醇 懸 浮 劑（100、50、25、12.5、6.25 mg·L-1），70%丙森鋅（1400、700、350、175、87.5 mg·L-1），10%苯醚甲環唑（5、2.5、1.25、0.625、0.321 5 mg·L-1），對照組則是在培養基中加入等量無菌水。使用已滅菌打孔器（直徑=5 mm）在分離純化后的菌落中打取菌餅1 塊，將其接種在PDA 平板中央，放置恒溫培養箱中（25 ℃）培養，用十字交叉法測量7 d 后的培養基菌落直徑，記錄數據，得出菌絲生長抑制率。求毒力回歸方程，計算EC50及相關系數。

抑制率/%=[1-（處理菌落直徑-菌餅直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]×100；

農藥質量濃度/（mg·L-1）=（含量百分數/稀釋倍數）×106。

1.3 數據處理

使用Excel 13.0 進行數據分析和繪圖制表。

2 結果與分析

2.1 山藥炭疽病田間癥狀及致病性測定

田間調查可見，山藥炭疽病發病初期為不規則的褐色小點，周圍伴有明顯的黃色暈圈，病斑擴大后中間凹陷，顏色呈淺灰褐色，邊緣呈黑褐色，病健界限明顯，見圖1。將病原菌離體接種到健康山藥葉片上，接種3 d 后觀察試驗接種癥狀，發病葉片病斑中間部位下陷，呈暗灰色，邊緣呈黑褐色，與田間觀察一致，空白處理不發病，見圖1。并且對發病病斑進行組織分離法后可重新分離鑒定為同一種病原菌。

圖1 山藥葉片致病性測定Fig.1 Pathogenicity determination of yam leaves

2.2 病原菌形態特征

從采集的9 份山藥炭疽病病葉中分離得到9份病原菌，獲得純培養后觀察（圖2），菌落正面菌絲較為致密，呈褐綠色毛氈狀，并形成幾圈散落的橙紅色孢子堆，具同心輪紋（圖2-A）。顯微鏡下觀察分生孢子為無色、圓桶形、兩端鈍圓、光滑、單孢、內有油滴狀顆粒物，大小為（14.4～19.7）μm×（4.6～5.9）μm（n=50）（圖2-C）。根據真菌分離物形態特征，初步鑒定為炭疽菌屬（Colletotrichum）。

圖2 炭疽菌屬形態特征Fig.2 Morphological characteristics of the Colletotrichum

2.3 分子生物學鑒定

為準確鑒定病原菌的種類，對該病原菌采用ITS 基因序列進行PCR 擴增，經電泳檢測可得500 bp左右的條帶。登錄NCBI 將測得的基因序列進行BLAST 比對（圖3），9 株病原菌（T2、T5、T6、T7、T9、T11、T12、T21、T22）的ITS 基因序列（登錄號依次 為：OQ607561.1、OQ607562.1、OQ607563.1、OQ607564.1、OQ607565.1、OQ607566.1、OQ607567.1、OQ607568.1、OQ607569.1），與已登錄的菌株Colletotrichum gloeosporioides（登錄號依次為EF208618.1、AJ311880.1），相似性在99%以上。使用MEGA 7 進行系統發育分析，該病原菌和膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）聚為一個分支，進一步表明該菌株為膠孢炭疽菌（Colletotri‐chum gloeosporioides）。

圖3 基于ITS 基因構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on ITS gene

2.4 室內毒力測定

由表1 可知，4 種化學藥劑的EC50大小順序為：70%丙森鋅可濕性粉劑＞5%己唑醇懸浮劑＞10%苯醚甲環唑水分散粒劑＞32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑，山藥炭疽病菌對后3 種化學藥劑表現敏感，其中山藥炭疽病病原菌對32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑最為敏感，其EC50為0.020 4 mg·L-1。

表1 供試殺菌劑對山藥炭疽病病菌的毒力回歸方程和EC50Table 1 Virulence regression equation and EC50 of the tested fungicides against the pathogen of yam anthracnose

3 討論與結論

炭疽病是山藥種植中普遍發生的真菌病害，該病主要危害葉和莖，不同地區山藥炭疽病的病原菌種類不同[13]。眾多研究結果表明，山藥炭疽病病原菌種類繁多，其中有關于膠孢炭疽菌Colletotri‐chum gloeosporioides的 報 道 最 多[7-8，14]。而 韓 曉 勇等[15]認為，引起紫山藥炭疽病的病原菌是喀斯特炭疽菌Colletotrichum karstii、膠孢炭疽菌Colletotri‐chum gloeosporioides、暹羅炭疽菌Colletotrichum si‐amense、隱秘炭疽菌Colletotrichum aenigma、薯蕷盤長孢菌Gloeosporium Pestis[15]和辣椒炭疽菌Col‐letotrichum capsici[16]。炭疽菌類真菌在屬和種的命名上曾經發生過重大變更，是同物異名，或是不同地域存在不同病原種，需要進一步深入了解。

目前，控制該病害的發生主要還是采用化學防治的手段，筆者在本試驗中采用4 種殺菌劑對雙峰青樹坪山藥炭疽病菌進行室內毒力測定，試驗結果表明，室內毒力測定中5%己唑醇懸浮劑、10%苯醚甲環唑水分散粒劑、32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑3 種化學藥劑對山藥炭疽病病原菌均具有較好的抑菌效果，這與陳建等[17]、張帥等[8]對炭疽病原菌的研究基本一致，而且32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑是一種高效低毒的新型復配殺菌劑，在辣椒、水稻等農作物病害防治中已有應用研究，在生產過程中，不但能提高對該病的防治效果，還降低了成本，有效減少了農藥用藥量，以及降低產生抗藥性的風險[18]。

筆者從雙峰青樹坪采集山藥炭疽病病樣9 份，分離得到9 株分離物，經致病性測定、形態學特征觀察、18S rDNA-ITS 基因序列分析，明確引起山藥炭疽病的病原物為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。該病原菌對5%己唑醇懸浮劑、32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑、10%苯醚甲環唑水分散粒劑3 種化學藥劑敏感，這些藥劑可用于山藥炭疽病的化學防治。通過對山藥炭疽病的發生危害調查、病原菌鑒定、致病性測定及病原菌室內毒力測定的研究，為今后該病害發生和流行規律研究及科學防治奠定了基礎。