基于ERK 信號通路研究補陽還五湯促糖尿病足潰瘍愈合的作用機制

賀倩倩 楊曉紅 曹 毅

糖尿病足潰瘍是糖尿病最常見的并發癥之一，目前治療主要有局部清創、高壓氧、封閉負壓引流、血管介入等，但均存在相應的禁忌證，且療程較長，人均治療費用高昂[1]。細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是細胞信號傳遞的關鍵，在創面愈合、炎癥反應等過程中扮演了重要的角色。在潰瘍愈合過程中，角質形成細胞參與了損傷修復的過程[2]。HaCaT 細胞由角質形成細胞培育而來，在細胞實驗中常被用于模擬人角質形成細胞。研究表明，ERK 信號途徑對HaCaT 細胞的增殖具有雙向調節作用[3]。臨床已證實補陽還五湯可通過改善血循、抑制血栓形成、改善周圍神經病變、控制血糖等有效促進糖尿病足潰瘍的愈合[4-6]。本實驗觀察補陽還五湯對HaCaT 細胞生物學行為的影響以及p-ERK1/2 表達水平的變化，探討補陽還五湯修復表皮的可能機制。

1 實驗材料

1.1 細 胞 HaCaT 細胞株購于中國科學院昆明細胞庫（批號CX0027）。

1.2 實驗試劑 補陽還五湯：生黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁（江陰天江藥業有限公司，劑型為顆粒劑）、ERK 抑制劑U0126（上海生工生物工程公司，批號9903S）、1640 培養基培養液（Hyclone公司，批號SH30809.01B）、胎牛血清（北京利維寧生物科技有限公司，批號11011-8611）、0.25%胰酶（吉諾科技公司，批號CM00231）、CCK-8（上海生工生物工程公司，批號E606335）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（美國Amersham 公司，批號PVDF022）、二喹啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Sigma 公司，批號BCA1-1KT）、增強型化學發光（ECL）顯色試劑盒（美國Amersham 公司，批號28990608）、兔抗人多克隆p-ERK1/2 抗體（美國Cell Signaling 公司，批號9101）、兔抗人多克隆ERK 抗體（美國Cell Signaling公司，批號9102）、生物素標記數二抗（山羊抗兔IgG）（美國Cell Signaling 公司，批號7074）。

1.3 主要儀器 超凈工作臺（上凈凈化，型號BSC-1000/1600IIA2 -1），-80 ℃超低溫冰箱（Thermo Forma 公司，型號Forma 700），倒置顯微鏡（重慶重光實驗有限公司，型號COIC-XJP-6A），酶聯免疫檢測儀（美國BioTek，型號ELx808IU），電泳儀及電泳槽（美國BIO-RAD 公司，型號PowerPac Basic），凝膠成像系統（美國BIO-RAD 公司，型號ChemiDoc XRS+）。

2 實驗方法

2.1 藥物配制和貯存 補陽還五湯：由生黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍5 g，地龍、川芎、紅花、桃仁各3 g 組成，將全方藥物放入鍋中，經水浴充分溶解，轉速3000 r/min、直徑20 mm，離心15 min，離心2 次，取上清，無菌過濾，濃縮至50 mg/mL；同樣方法分別配置5、10、15、25 mg/mL 補陽還五湯，-20 ℃保存。ERK抑制劑（U0126）：用1640 培養基稀釋至10 mmol/L，-20 ℃保存。

2.2 HaCaT 細胞的培養及傳代 HaCaT 細胞培養液為含有10%胎牛血清的1640 培養液，培養于37 ℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養箱。待細胞融合約瓶底85%～95%狀態時，用胰酶消化，以1∶3 的比例接種到培養瓶中。

2.3 CCK-8 法

2.3.1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞增殖的影響 （1）待細胞長滿96 孔板板底約50%時，移出培養液，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2 次；（2）每孔加入200 μL 含有不同濃度補陽還五湯（0、5、10、15、25、50 mg/mL）的1640 培養基，繼續孵育24 h；（3）每孔加入20 μL CCK-8 溶液和180 μL 1640 培養基，放置培養箱中30 min；（4）置于分光光密度儀450 nm讀取吸光度值。

2.3.2 補陽還五湯對ERK 抑制劑（U0126）作用下HaCaT 細胞增殖的影響 （1）同“2.3.1”的（1）；（2）本實驗設四組：空白組、補陽還五湯組、ERK 抑制劑組、ERK 抑制劑聯合補陽還五湯作用組（聯合組），根據實驗設組，分別加入200 μL 用1640 培養基稀釋的25 mg/mL 補陽還五湯和25 μmol/L ERK 抑制劑（U0126），繼續孵育24 h；（3）后續操作同“2.3.1”中的（3）、（4）。

2.4 Western blot 法

2.4.1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞ERK1/2蛋白表達的影響 設立0、5、15、25 mg/mL 補陽還五湯組。收集各組細胞，用預冷的PBS 緩沖液洗滌3次，裂解細胞，離心后收集蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度。根據所測蛋白濃度，計算40 μg 溶液蛋白的體積為上樣量。將40 μg 樣品蛋白電泳、轉膜，4 ℃過夜孵育一抗（1∶1000）。一抗反應結束后，用1×TBST 在搖床上室溫洗3 次，每次10 min；室溫孵育二抗2 h（1∶1000），最后用ECL 試劑盒顯影拍照。

2.4.2 25 mg/mL 補陽還五湯對ERK 抑制劑（U0126）作用下HaCaT 細胞p-ERK1/2 蛋白表達的影響 設立空白組、ERK 抑制劑組、補陽還五湯組、ERK 抑制劑聯合補陽還五湯組（聯合組），余步驟同“2.4.1”。

2.5 細胞劃痕實驗 設立空白組和25 mg/mL 補陽還五湯組，根據分組，在6 孔板中加入約5×105個細胞，24 h 后換無血清培養基，用10 μL 槍頭均勻地在培養皿中劃痕，PBS 洗滌2 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，拍照（0 h），然后放入37 ℃的5%CO2培養箱中，每12 h 測量1 次細胞運動的距離，計算遷移率。

2.6 統計學方法 應用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，實驗所得數據以均數±標準差（±s） 表示，上述所有實驗均重復3 次以上，采用單因素方差分析；P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 CCK-8 法檢測不同濃度補陽還五湯對HaCaT細胞增殖的影響 與空白組比較，補陽還五湯濃度依賴性促進HaCaT 細胞增殖（P＜0.05 或P＜0.01），在25 mg/mL 時促增殖效應最佳。見表1。

表1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞增殖影響的比較（±s）

表1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞增殖影響的比較（±s）

注：HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；與空白組（0 mg/mL）比較，aP＜0.05，bP＜0.01

補陽還五湯濃度（mg/mL）孔數051 0 15 25 50 666666吸光度值1.0514±0.080 1.1704±0.076a 1.2642±0.078b 1.3845±0.060b 1.6996±0.080b 1.7211±0.088b

3.2 Western blot 法檢測不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞p-ERK1/2 蛋白表達的影響 與空白組比較，補陽還五湯呈濃度依賴性促進HaCaT 細胞p-ERK1/2 蛋白的表達（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞p-ERK1/2 表達的影響

表2 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞p-ERK1/2表達量的比較（±s）

表2 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞p-ERK1/2表達量的比較（±s）

注：HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；ERK1/2 為細胞外調節激酶1/2；p-ERK1/2 為磷酸化ERK1/2；與空白組（0 mg/mL）比較，aP＜0.01；與5 mg/mL 補陽還五湯濃度組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與15 mg/mL 補陽還五湯濃度組比較，dP＜0.01

補陽還五湯濃度（mg/mL）實驗次數051 5 25 3333 p-ERK1/2/ERK1/2 0.260±0.092 0.545±0.005a 1.038±0.126ab 2.414±0.456acd

3.3 劃痕實驗檢測25 mg/mL 補陽還五湯對HaCaT細胞遷移的影響 與空白組比較，25 mg/mL 補陽還五湯有效促進HaCaT 細胞遷移（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

表3 HaCaT 細胞劃痕遷移結果比較（±s）

表3 HaCaT 細胞劃痕遷移結果比較（±s）

注：HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；空白組給予0 mg/mL 補陽還五湯；補陽還五湯組給予25 mg/mL 補陽還五湯；與空白組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別空白組補陽還五湯組實驗次數平均遷移率33 12 h 0.43±0.02 0.55±0.06a 24 h 0.58±0.06 0.84±0.06b

3.4 CCK-8 法檢測補陽還五湯對ERK 抑制劑作用下HaCaT 細胞增殖的影響 與ERK 抑制劑組比較，25 mg/mL 補陽還五湯能明顯促進ERK 抑制劑作用下的HaCaT 細胞的增殖（P＜0.01）。見表4。

表4 補陽還五湯對ERK 抑制劑作用下HaCaT 細胞增殖的影響（±s）

表4 補陽還五湯對ERK 抑制劑作用下HaCaT 細胞增殖的影響（±s）

注：空白組不加補陽還五湯及ERK 抑制劑（U0126）；ERK 抑制劑組給予25 μmol/L ERK 抑制劑（U0126）；補陽還五湯組給予25 mg/mL 補陽還五湯；聯合組給予25μmol/L ERK 抑制劑（U0126）和25 mg/mL 補陽還五湯；HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；ERK 抑制劑為細胞外調節激酶抑制劑；與空白組比較，aP＜0.01；與ERK 抑制劑組比較，bP＜0.01

組別空白組ERK 抑制劑組補陽還五湯組聯合組孔數6666吸光度值1.2629±0.126 1.0474±0.056a 1.6237±0.200a 1.3167±0.088b

3.5 Western blot 法檢測25 mg/mL 補陽還五湯和ERK 抑制劑對HaCaT 細胞p-ERK1/2 表達的影響與空白組相比，25 mg/mL 補陽還五湯可以促進p-ERK1/2 蛋白的表達，同時促進ERK 抑制劑（U0126）作用下p-ERK1/2 蛋白的表達（P＜0.01）。見圖2、表5。

圖2 補陽還五湯和ERK 抑制劑對HaCaT 細胞p-ERK1/2 表達的影響

表5 補陽還五湯和ERK 抑制劑對HaCaT 細胞p-ERK1/2表達量的比較（±s）

表5 補陽還五湯和ERK 抑制劑對HaCaT 細胞p-ERK1/2表達量的比較（±s）

注：空白組不加補陽還五湯及ERK 抑制劑（U0126）；ERK 抑制劑組給予25 μmol/L ERK 抑制劑（U0126）；補陽還五湯組給予25 mg/mL 補陽還五湯；聯合組給予25 μmol/L ERK 抑制劑（U0126）和25 mg/mL 補陽還五湯；HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；ERK1/2 為細胞外調節激酶1/2；p-ERK1/2 為磷酸化ERK1/2；與空白組比較，aP＜0.01；與ERK抑制劑（U0126）組比較，bP＜0.01；與補陽還五湯組比較，cP＜0.01

組別空白組ERK 抑制劑組補陽還五湯組聯合組實驗次數3333 p-ERK1/2/ERK1/2 0.900±0.127 0.356±0.108a 1.677±0.319ab 0.855±0.008bc

4 討 論

糖尿病足潰瘍的修復是個復雜的生物學過程，主要依靠角質形成細胞、成纖維細胞及相應的細胞因子互相作用，完成損傷部位的再上皮化。角質形成細胞在這個過程中發揮了重要作用，它通過大量增殖、遷移等生物學行為修復、覆蓋創面，主導創面的再上皮化過程，同時，分泌各種細胞因子和生長因子，共同調控并促進創面愈合的過程[7-8]。研究顯示，再上皮化過程可通過激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調解蛋白激酶（MAPK/ERK）信號通路在體外調節角質形成細胞遷移[9]。ERK 信號通路是細胞信號傳遞的關鍵，激活后介導細胞因子的轉錄活化，調節細胞生命進程，參與細胞增殖、分化、凋亡，參與維持細胞形態，構建細胞骨架等多種生物學反應。葛新紅等[10]在實驗中發現，隨著糖尿病病程的延長，糖尿病大鼠背部皮膚表皮與真皮厚度逐漸變薄，且p-ERK1/2 的表達逐漸下降。唐乾利等[11]研究表明，通過調控ERK1/2 信號通路，進而改變病理炎癥反應狀態，促進慢性難愈合創面的修復。上述研究證實，ERK 信號通路與潰瘍創面的愈合密切相關。本研究結果顯示，ERK 抑制劑能抑制HaCaT 細胞的增殖及p-ERK1/2 蛋白的表達（P 均＜0.01）。

中醫學認為，糖尿病足潰瘍屬于“消渴”“脫疽”“脈痹”的范疇，主要由于氣陰虧虛、瘀阻脈絡、外感濕熱等導致，早期本虛以氣虛、陽虛為主，成癰期多見氣陰兩虛夾瘀，潰瘍期以氣血陰陽虧虛為主，但脈絡瘀阻貫穿疾病始終，是最關鍵的發病因素[12-14]，因此治療原則在于補益氣血、活血化瘀。本實驗所用的補陽還五湯出自清代王清任《醫林改錯》，此方大劑量黃芪補脾胃之氣而生營血，外走肌表生肌托瘡，輔以歸尾補血行血，赤芍、川芎、桃仁、紅花化瘀行滯，地龍通絡活血，共奏氣旺血行、瘀消脈通之效。目前已有臨床研究顯示，補陽還五湯可促進糖尿病足潰瘍的愈合[15-16]。本研究結果顯示，補陽還五湯能濃度依賴性促進HaCaT 細胞的遷移和增殖（P＜0.05），且觀察到產生上述影響的機制與激活ERK 信號通路有關。同時在ERK 信號通路受到抑制的情況下，補陽還五湯仍能部分逆轉ERK 信號通路抑制劑對HaCaT 細胞增殖的抑制作用（P＜0.05）。

綜上，本研究驗證了補陽還五湯可通過ERK 信號通路的激活發揮生物學作用，但補陽還五湯是否通過其他途徑或者其他信號通路促進角質形成細胞的增殖和遷移還有待進一步研究，且單一細胞實驗難以完全模擬糖尿病足潰瘍的真實環境，補陽還五湯是否還通過對其他類型細胞的影響進一步促進糖尿病足潰瘍的愈合也有待進一步研究。