基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究補陽五湯治療脊髓損傷的作用成分和機制

李 杰 周邦瑜 馬彥博 李紹波

在我國脊髓損傷發(fā)病率高達50.484 人次/百萬人，且具有較高的致殘性[1]。目前主要通過大劑量激素沖擊治療，但因為嚴重不良反應(yīng)，已不推薦[2]。補陽還五湯記載于清代醫(yī)學(xué)家王清任著作的《醫(yī)林改錯》中，共由7 味中藥（黃芪、赤芍、歸尾、川芎、地龍、桃仁和紅花）組成，是益氣活血的代表藥方[3]。有學(xué)者將其應(yīng)用到脊髓損傷治療中取得良好效果[4]。然而，由于補陽還五湯成分多、機制復(fù)雜，其治療脊髓損傷的具體機制尚不清楚。因此，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接等現(xiàn)代研究技術(shù)，揭示補陽還五湯治療脊髓損傷的作用成分和機制。

1 材料與方法

1.1 補陽還五湯的作用成分和對應(yīng)靶點的篩選及校正 通過（https://www.tcmsp-e.com/，TCMSP）結(jié)合文獻查閱，收集補陽還五湯七味中藥作用成分及其靶點蛋白信息。口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18 則認為該成分具有藥物活性。將藥物活性成分對應(yīng)的靶點蛋白信息與數(shù)據(jù)庫UniProt（https://www.uniprot.org）中的蛋白信息進行匹配校正。

1.2 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在Cytoscape（https://cytoscape.org/）軟件中導(dǎo)入中藥、成分和靶點信息，構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，然后使用軟件插件工具（Network Analyser）計算各節(jié)點的重要參數(shù)，獲取藥物主要的作用成分。

1.3 脊髓損傷的治療靶點篩選和韋恩圖構(gòu)建 以“spine core injure”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中進行檢索，通過參數(shù)“relevance score”的中位數(shù)進行脊髓損傷靶點篩選。取標準化處理后的補陽還五湯作用靶點與脊髓損傷疾病靶點的交集，使用（http://www.bioinformatics.com.cn）在線網(wǎng)站構(gòu)建交集靶點韋恩圖。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點篩選 將“1.3”獲得的交集靶點按照物種“人類”，中等置信度≥0.9，導(dǎo)入STRING 庫（https://string-db.org/）。檢索后將文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)可視化網(wǎng)絡(luò)，使用網(wǎng)絡(luò)分析工具進行拓撲。根據(jù)“degree”值（度值）大小篩選關(guān)鍵靶點，以圖形大小表示度值的大小，進行展示。

1.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析 在DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）中導(dǎo)入交集靶點，依次選擇“官方基因標志”“基因列表”“人類”，進行GO 生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）和KEGG通路注釋，并繪制可視化的氣泡圖（http://www.bioinformatics.com.cn）。

1.6 主要作用成分與核心靶點蛋白的分子對接 從數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點蛋白，應(yīng)用AutoDockTools（https://autodock.scripps.edu/）對其中的配體分子進行提取，去掉水分子，加入氫原子。使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取主要作用成分的三維結(jié)構(gòu)。通過半柔性對接，以核心靶點蛋白為受體，以主要作用成分為配體，利用Pymol（https://pymol.org/2/）展示對接結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 補陽還五湯作用成分及相關(guān)靶點信息 經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選化合物：赤芍14 個，川芎6 個，當歸2 個，紅花16 個，黃芪17 個，桃仁19 個。地龍在TCMSP 中未錄入，通過查找文獻得到其有效成分1個。去掉重復(fù)和缺乏有效靶點信息的化合物后，共獲得63 個藥物作用成分及260 個相對應(yīng)靶點蛋白。

2.2 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò) 網(wǎng)絡(luò)共有330 個節(jié)點（7 個中藥，63 個作用成分，260 個靶點）和1296 條邊，兩節(jié)點間的連線越多，表示相互關(guān)系越緊密。其中菱形代表靶點，圓形代表中藥，八邊形代表中藥活性成分，三角形代表藥物共有活性成分（見圖1）。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析，度值前10 的是：槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、黃芪素、木犀草素、7-甲氧基異微凸劍葉莎醇、刺芒柄花素、異鼠李素、常春藤皂苷元、黃芩苷。見表1。

圖1 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.3 補陽還五湯治療脊髓損傷靶點 篩選得到752個脊髓損傷疾病相關(guān)靶點。共有106 個交集靶點，見圖2。

圖2 補陽還五湯治療脊髓損傷韋恩圖

2.4 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶點的篩選

取“2.3”中的交集靶點構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，共有106 個節(jié)點（靶點蛋白）和498 條邊（蛋白相互作用）。選取度值排名前20 關(guān)鍵靶點在內(nèi)圈展示，分別是TP53、AKT1、MAPK1、RELA、TNF、CTNNB1、IL6、ESR1、MAPK14、FOS、EGFR、MYC、RB1、IL10、MAPK8、CCND1、HIF1A、CDKN1A、CAV1、AR。見圖3。

TCMSP MOL000098 MOL000422 MOL000359 MOL002714 MOL000006 MOL000378 MOL000296 MOL000354 MOL000392 MOL002776成分代號B2 B1 A3 A1 HH5 HQ9 B3 HQ3 HQ5 A2化合物名稱quercetin kaempferol beta-sitosterol baicalein luteolin 7-O-methyli somucronulatol hederagenin isorhamnetin formononetin Baicalin中文名稱槲皮素山奈酚β-谷甾醇黃芪素木犀草素7-甲氧基異微凸劍葉莎醇常春藤皂苷元異鼠李素刺芒柄花素黃芩苷OB（%）46.43 41.88 36.91 33.52 36.16 74.69 36.91 49.6 69.67 40.12來源黃芪、紅花黃芪、紅花赤芍、當歸、紅花、桃仁赤芍、紅花紅花黃芪黃芪、桃仁黃芪黃芪赤芍、紅花DL 0.28 0.24 0.75 0.21 0.25 0.3 0.75 0.31 0.21 0.75度值307 123 118 72 58 46 46 40 40 35

圖3 補陽還五湯治療脊髓損傷的關(guān)鍵靶點

2.5 GO 功能和KEGG 通路分析 對排名前20 的關(guān)鍵靶點進行GO 功能分析，共獲得GO 條目304個。其中BP242 個，CC18 個，MF44 個。BP 顯示，關(guān)鍵靶點主要與基因表達、轉(zhuǎn)錄、凋亡、MAPK 信號、對活性氧反應(yīng)等過程相關(guān)；CC 顯示，關(guān)鍵靶點構(gòu)成大分子復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，廣泛分布細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜及細胞外基質(zhì)、線粒體等部位；MF 顯示，關(guān)鍵靶點可影響蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸、轉(zhuǎn)錄因子以及一氧化氮合酶和轉(zhuǎn)錄激酶活性。見圖4。

通過KEGG 分析得到信號通路128 條，將與脊髓損傷明顯無關(guān)的癌癥和病毒感染等通路棄去，根據(jù)“count 值”排序，取前15 條通路繪制氣泡圖（見圖4）。結(jié)果顯示，多數(shù)基因富集在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子（FoxO）、磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）、Toll 樣受體（TLRs）、腫瘤壞死因子（TNF）等通路，而且排名前4 的核心靶點TP53、AKT1、MAPK1、RELA 均被富集。見表2。

2.6 分子對接結(jié)果 槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇是補陽還五湯排名前3 位的主要成分，TP53、AKT1、MAPK1、RELA 是補陽還五湯治療脊髓損傷的核心靶點，將二者進行兩兩對接，共得到12 組配體-受體對接結(jié)果，結(jié)果見表3。圖5 展示部分對接結(jié)果的三維圖。

3 討 論

本研究表明，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇是補陽還五湯的主要作用成分。槲皮素可以激活PI3K/Akt通路調(diào)控自噬，改善脊髓損傷后大鼠運動功能[5]。除此之外，槲皮素也可抑制Toll 樣受體4（TLR4）-核因子-κB（NF-κB）信號通路減輕脊髓損傷大鼠的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，促進運動功能恢復(fù)和減輕脊髓空洞形成[6]。山奈酚可以抑制MAPK 和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）磷酸化，減少小膠質(zhì)細胞活化和氧化應(yīng)激[7]。β-谷甾醇可抑制p38 蛋白激酶（p38 MAPK）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、NF-κB 通路，減少炎性介質(zhì)白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、環(huán)氧化酶-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達[8]。

TP53、AKT1、MAPK1、RELA 在補陽還五湯治療脊髓損傷中起到核心作用。脊髓損傷后，小膠質(zhì)細胞外泌體可通過調(diào)控p53 蛋白參與神經(jīng)元凋亡和軸突再生[9]。和TP53 一樣，AKT1 也可調(diào)控細胞存活和凋亡，抑制AKT-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，減輕脊髓損傷大鼠炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元調(diào)亡，減少膠質(zhì)瘢痕[10]。另外，通過對脊髓損傷模型兔行減壓手術(shù)后發(fā)現(xiàn)，由脊髓損傷引起的p-AKT 蛋白的上調(diào)被逆轉(zhuǎn)，兔的運動功能有了恢復(fù)趨勢[11]。脊髓損傷后MAPK1 表達顯著上調(diào)，抑制MAPK1 可以促進大鼠運動恢復(fù)[12]。RELA 是NF-κB 家族的重要成員，又名p65，在調(diào)節(jié)炎癥、免疫應(yīng)答等活動中起重要作用。抑制NF-κB p65 通路可減少炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 釋放，促進脊髓損傷大鼠運動恢復(fù)和軸突再生[13]。

Gene MAPK8，MYC，MAPK1，AKT1，F(xiàn)OS，MAPK14，TNF，TP53，RELA，EGFR IL6，CDKN1A，CCND1，MYC，MAPK1，AKT1，TP53，RELA，EGFR IL10，IL6，CDKN1A，MAPK8，CCND1，MAPK1，AKT1，MAPK14 EGFR IL6，MAPK8，MAPK1，AKT1，F(xiàn)OS，MAPK14，TNF，RELA IL6，MAPK8，MAPK1，AKT1，F(xiàn)OS，MAPK14，TNF，RELA KEGG 通路MAPK PI3K-Akt FoxO Toll 樣受體TNF Count 10 9988

KEGG 分析顯示，主要核心靶點富集在MAPK、PI3K-Akt、FoxO、TLRs、TNF 等通路。MAPK 是調(diào)控炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡的信號通路。甘草苷治療脊髓損傷大鼠，可顯著降低損傷組織中的磷酸化p38 MAPK 表達，減少中性粒細胞浸潤和神經(jīng)元的調(diào)亡[14]。PI3K/Akt 具有調(diào)控細胞凋亡、增殖、血管生成以及向體內(nèi)穩(wěn)態(tài)遷移等功能。抑制PI3K/Akt 通路可促進骨髓間質(zhì)干細胞遷移，有利于脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)[15]。FOX 家族成員的表達與脊髓損傷后的肌肉萎縮密切相關(guān)[16]，另外調(diào)節(jié)叉頭轉(zhuǎn)錄因子3a（FoxO3a）可減輕脊髓損傷后的調(diào)亡水平[17]。TLRs 與TNF 通路均與炎癥表達相關(guān)。臨床分析表明，脊髓損傷患者血清中TLR4、NF-κB、TNF-α、白細胞介素-12（IL-12）水平均高于健康體檢者[18]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，證明補陽還五湯中主要作用成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇通過干預(yù)TP53、AKT1、MAPK1、RELA等靶點，通過MAPK、PI3K-Akt、FoxO、TLRs、TNF 等信號通路來實現(xiàn)對脊髓損傷的治療作用，為下一階段的深入研究提供參考依據(jù)。