超高效液相色譜-串聯質譜法測定人血清美羅培南濃度的研究

朱丹萍 羅敬銘 蔡鑫君

美羅培南是一種抗菌譜較廣的碳青霉烯類抗生素，對多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等病原體具有很強的抗菌活性，臨床上主要用于多重耐藥菌感染的治療[1-2]。靜脈給予美羅培南后，其在體內分布廣，大部分藥物以原型經腎臟排出，半衰期約為1 h[3]。美羅培南屬于時間依賴性抗生素，具有相對較長的抗生素后效應，且血漿中的抗生素濃度超過致病菌的最低抑制濃度才能達到足夠的殺菌效果；同時合并多種疾病的危重癥患者的藥代動力學參數會發生變化[4]。有部分證據證實，根據血藥濃度采取積極的措施調整美羅培南用量有利于患者預后[5]。因此，在使用美羅培南的過程中引入治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM），可以為用藥劑量的調整提供重要的參考依據，以達到提高療效、減少毒副作用的目的[6]。

超高效液相色譜串聯質譜法（ultra-high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）是一種具有高度敏感性和選擇性的檢測方法，被用于多種抗生素類藥物的血藥濃度監測。與高效液相色譜法相比較，UPLC-MS/MS 具有檢測速度快，靈敏度更高，不要求被分析物峰完全分離，樣本需求量更少等優勢[7]。本研究旨在開發一種高效、快速、準確的UPLC-MS/MS，用于測定人血清中的美羅培南濃度。

1 材料與方法

1.1 試劑和標準品 甲醇和乙腈為質譜級，購自美國Supelco 公司，HPLC 級乙腈購自美國的Honeywell 公司，質譜級甲酸購自上海Macklin 公司。使用的色譜柱ZORBAX PRHD SB-Aq（3×50 mm，1.8 μm）購自美國安捷倫公司。

標準物質美羅培南購自中檢所，內標物質美羅培南-D6 購自Bepure 公司。

1.2 儀 器 UPLC-MS/MS 系統由Xevo TQ-S IVD三重四極桿質譜儀和ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜系統（Waters Corporation，MLF，USA）組成。其他儀器還有：高速冷凍離心機（Eppendorf 5425R，德國）、超純水儀（Heal Force SMART-N，香港）、渦旋混合器（Vortex-Genie2，美國）和移液器（Eppendorf，德國）。

1.3 標準工作液、內標工作液和質控樣品的制備精密稱取一定量的美羅培南標準品，溶于超純水中，配制成濃度為1 mg/mL 的儲備液。精密稱取一定量的美羅培南-D6 內標，溶于甲醇中，配制成1 mg/mL濃度的儲備液。以超純水為稀釋劑，配制美羅培南含量分別為1000、400、200、100、40、20、10、5 μg/mL 的標準曲線溶液。取內標儲備液10 μL 加入到9.99 mL的甲醇溶液中，作為內標溶液。

按照上述方法，制備4 個濃度水平的質控樣品，分別為定量下限（5 μg/mL）、低濃度質控樣品（10 μg/mL）、中等濃度質控樣品（200 μg/mL）、高濃度質控樣品（800 μg/mL）。

1.4 樣品的制備 取血清45 μL 于1.5 mL 離心管中，加入5 μL 的標曲或質控溶液混勻，加入內標溶液200 μL 沉淀。渦旋混勻后在4 ℃，12000 r/min 條件下離心5 min。然后將100 μL 的上清液轉移到1.5 mL離心管中，加入400 μL 的超純水稀釋，渦旋混勻后，取100 μL 樣品進行UPLC-MS/MS 分析。

1.5 UPLC-MS/MS 條件 流動相A 為0.1%甲酸水，流動相B 為甲醇。流速為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測時間為4.5 min。色譜柱為ZORBAX PRHD SBAq（3×50 mm，1.8 μm）。進樣量為10 μL。梯度洗脫程序見表1。

時間（min）0 0.5 2 3.5 4.5 A（%）95 95 B（%）55 55 95 95 95 5

質譜離子源為電噴霧離子源，質譜掃描模式為正離子模式（ESI，MS+）。電壓設定為3.00 kV。解吸氣體溫度和流速為500 ℃，900 L/Hr。錐形氣體流速為150 L/Hr，噴霧氣體壓力設定為7.00 Bar。此外，碰撞氣體的流速為0.16 mL/min。具體參數見表2。

化合物美羅培南美羅培南-D6母離子（m/z）384.40 390.28子離子（m/z）254.30 346.30錐孔電壓（V）20 2碰撞電壓（V）20 8

1.6 方法驗證

1.6.1 選擇性 按照“1.4”的方法采用6 個不同來源的血清分別制備空白基質樣品，按照“1.4”的方法處理美羅培南定量下限樣品。將空白基質樣品的響應值和定量下限樣品的響應值進行比較。空白基質樣品中美羅培南的響應值不能超過定量下限樣品中響應值的20%，內標則不能超過5%。

1.6.2 標準曲線 根據美羅培南的有效治療范圍確定美羅培南的標準曲線范圍，采用同位素內標定量法，利用MassLynx 軟件以標準品與內標物的濃度比為X 軸，標準品與內標物峰面積比為Y 軸，建立標準曲線。

1.6.3 準確度和精密度 在四個濃度水平（定量下限、低質控濃度、中等質控濃度和高質控濃度）建立了QC 樣品，每個QC 樣品有6 個重復。在3 d 內進行了至少3 批次的分析，獲得的數據用來驗證批次內和批次間的準確度和精密度。

準確度是指測量濃度與標稱濃度之間的百分比差異。準確度的接受標準是在除定量下限以外的質控濃度水平上，測量濃度和標稱濃度之間的差異小于15%（在定量下限水平上小于20%）。精密度是指重復樣品的測量值的變異系數。精密度的接受標準是在定量下限以外的質量控制濃度水平上，變異系數小于15%（在定量下限水平上小于20%）。

1.6.4 基質效應和殘留效應 本方法在兩個濃度水平（低質控濃度和高質控濃度）驗證了基質效應。采用不同來源的血清制備了多個空白基質樣本（n=6），將它們與不含基質的樣品（n=3）做對比。由此計算出內標歸一化基質效應因子。

為了驗證殘留效應，在連續進樣三次高質控濃度樣品后，立即進樣一次空白基質樣品，重復多次。空白基質樣品中的美羅培南信號應當小于定量下限水平的20%，內標信號應當小于5%。

1.6.5 儲存穩定性 為驗證美羅培南在-20 ℃儲存條件下的穩定性，配制了定量下限和定量上限溶液，存放在-20 ℃冰箱14 d、28 d，采用超純水將新鮮配制的定量下限、定量上限溶液一起稀釋至定量下限濃度，平行配制各6 份，以存放在-20 ℃冰箱14 d、30 d 溶液與新鮮配制溶液的峰面積比值來評價藥物的穩定性，峰面積變化在±15%以內證明其穩定。

2 結 果

2.1 選擇性 美羅培南和美羅培南-D6 的出峰時間都為2 min（見圖1A～D），但是UPLC-MS/MS 法按照分子量作為區分不同化合物的依據，因此相同的出峰時間也可以準確定量美羅培南和內標。選擇性結果顯示空白基質樣品中美羅培南色譜峰響應極低，不存在造成干擾的內源性物質（見圖1E）。

圖1 美羅培南內標（A），標準品的低、中、高質控樣本（B～D）和空白基質樣本（E）的色譜圖

2.2 標準曲線 經過驗證，美羅培南的回歸方程為y=0.1370*x-0.0042（R2=0.997），在0.5～100 μg/mL 的濃度范圍內線性良好，定量下限為0.5 μg/mL。

2.3 準確度和精密度 在3 d 內進行了3 個批次（n=6）質控樣品的檢測，美羅培南的批內，批間準確度、精密度見表3。其中定量下限的批內精密度不超過1.61%；批間準確度在100.40%～107.10%之間，批間精密度不超過2.23%。低質控濃度的批內精密度不超過1.57%；批間準確度在88.90%～95.90%之間，批間精密度不超過2.26%。中質控濃度的批內精密度不超過1.41%；批間準確度在94.50%～99.60%之間，批間精密度不超過1.31%。高質控濃度的批內精密度不超過1.29%；批間準確度在97.90%～114.00%之間，批間精密度不超過6.27%。

2.4 基質效應和殘留效應 在低質控濃度和高質控濃度上，使用6 個不同來源的基質制備的樣品來評估基質效應。結果見表4。低質控濃度下，美羅培南的基質效應因子在1.026～1.056 之間，而高質控濃度下，則在1.090～1.104 之間。

在最高濃度的質控樣品進樣后，空白基質樣品中的美羅培南的信號在0.86%～5.51%之間，而內標的信號幾乎沒有（0%～0.04%）。因此，可以認為該分析方法沒有殘留效應。

化合物美羅培南質控濃度定量下限低質控濃度中質控濃度高質控濃度標稱濃度（μg/mL）0.5 1 20 80批內批間準確度（RE，%）3.10/7.10-11.10/-8.90-3.60/-0.40 12.00/14.00精密度（CV，%）1.61 1.57 1.41 1.29準確度（RE，%）0.40/7.10-11.10/-4.10-5.50/-0.40-2.10/14.00精密度（CV，%）2.23 2.26 1.31 6.27

2.5 儲存穩定性 美羅培南的14 d 穩定性和28 d穩定性的結果（以回收率表示）見表4。儲存14 d 和28 d 的定量上限和定量下限溶液峰面積變化在±15%以內，說明在-20 ℃的儲存條件下，美羅培南在28 d 內具有良好的穩定性。

3 討 論

本研究建立了UPLC-MS/MS 法測定人血清中美羅培南的濃度，該方法特異性強、重復性好，樣品分析時間為4.5 min，縮短了樣品檢測時間，能夠滿足臨床監測的需求。

美羅培南具有時間依賴性，游離抗生素濃度超過最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的時間百分比是其療效的評價指標，美羅培南的血藥濃度保持在MIC 以上的時間越長，其臨床治療的成功率就越高，濃度不足可能會導致患者治療失敗并增加細菌耐藥的可能性[8]。另一方面，腎功能下降也可能導致血藥濃度增加，從而導致血藥濃度增加、產生潛在毒性[9]。因此，開展美羅培南的TDM，一方面可以解決藥物劑量不足的問題，避免耐藥情況的發生，另外一方面還可以優化腎功能不全患者的給藥方案。在達到治療目標的前提下，給予患者更精準的藥物劑量，不但可以改善臨床療效，避免毒副作用，同時還可以節省大量的醫療費用。

本研究建立的檢測方法的線性范圍廣，在0.5 ～100 μg/mL 之間，涵蓋了美羅培南的臨床治療血藥濃度范圍。同時該方法選擇性良好，準確度和精密度符合要求，無明顯的基質效應和殘留效應，儲備液在-20 ℃的穩定性良好。但美羅培南在室溫下易降解、穩定性差，應在樣本采集后盡快完成樣本處理、檢測，如不能在第一時間進行測定，應將美羅培南血液樣本離心后，置于-80 ℃保存[10]。綜上所述，本研究建立了準確、可靠、簡單、快速的美羅培南檢測分析方法，以期為美羅培南藥物的臨床監測提供技術支持。