微小RNA-106a-5p/集落刺激因子1軸對(duì)狼瘡性腎炎患者免疫球蛋白G誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的影響

秦藝璐, 邊彩月, 左淑飛, 吳 潔, 梁 舒, 許振丹, 范文強(qiáng)

(河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 河南 新鄉(xiāng), 453000)

狼瘡性腎炎(LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的常見(jiàn)腎臟損害,多達(dá)60%的紅斑狼瘡患者會(huì)發(fā)展為L(zhǎng)N, 而這是紅斑狼瘡患者的主要死亡原因[1-2]。發(fā)生腎炎會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)漏出,如果不加以控制, LN最終會(huì)導(dǎo)致腎功能衰竭。目前, LN的主要治療方法是使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和新興的生物制劑[3]。足細(xì)胞是腎臟中高度分化的上皮細(xì)胞,其活性和結(jié)構(gòu)完整性在維持腎小球選擇性濾過(guò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并在LN的發(fā)展中起重要作用[4-5]。微小核糖核酸(miRNAs)已被發(fā)現(xiàn)在多種病理和生理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[6-7]。研究[8-9]證實(shí)miRNAs在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等多種生物過(guò)程中具有調(diào)控功能。有研究[10]表明miRNAs在腎臟發(fā)育中起著重要作用,其失調(diào)可能導(dǎo)致LN腎臟細(xì)胞異常增殖、炎癥和纖維化。

微小RNA-106a-5p(miR-106a-5p)是一個(gè)功能miRNA, 被發(fā)現(xiàn)在LN患者中表達(dá)降低,但其在LN發(fā)展中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。此外,通過(guò)Starbase預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p在集落刺激因子1(CSF1)的基因上存在結(jié)合位點(diǎn),而CSF1被證實(shí)在LN患者中呈高表達(dá),并參與促進(jìn)足細(xì)胞的損傷過(guò)程[11]。本研究采用LN患者血清中提取的免疫球蛋白G(LN-IgG)刺激足細(xì)胞誘導(dǎo)體外LN環(huán)境,探討miR-106a-5p在足細(xì)胞損傷及LN中的作用,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)從本院共招募24例LN患者以及21名健康志愿者,納入時(shí)間為2021年9月—2022年5月,并收集所有參與者血清標(biāo)本用于miR-106a-5p和CSF1的表達(dá)檢測(cè)以及LN-IgG和陰性對(duì)照(NC)-IgG(來(lái)自健康志愿者)提取和純化。

人足細(xì)胞(HPC)購(gòu)自ATCC(美國(guó)); 胎牛血清、RPMI-1640購(gòu)自Gibco(美國(guó)); Lipofectamine 2000試劑盒、Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen(美國(guó)); miR-106a-5p mimic、miR-NC、CSF1及pcDNA由廣州銳博合成; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒由Takara(日本)提供; CCK-8試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒由北京索萊寶提供; 雙熒光素酶報(bào)告基因載體及檢測(cè)試劑盒由Promega(美國(guó))提供; ELISA試劑盒,抗LC3-Ⅰ/Ⅱ, p62, CSF1和GAPDH一抗抗體,以及HRP二抗購(gòu)自Abcam(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 血清IgG的提取和測(cè)定: 通過(guò)蛋白質(zhì)親和色譜柱,洗滌、負(fù)載柱、平衡、負(fù)載樣品、洗滌、洗脫和中和,分離和純化患者及健康志愿者血清IgG, 分別命名為L(zhǎng)N-IgG和NC-IgG,測(cè)定IgG的濃度后,放置于-80 ℃環(huán)境中保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組: 足細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中,條件為37 ℃、5%CO2。培養(yǎng)基中包含胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(ITS)和10%胎牛血清。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含ITS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d, 誘導(dǎo)足細(xì)胞分化,隨后將其暴露于LN-IgG或NC-IgG中培養(yǎng),用于miR-106a-5p和CSF1的表達(dá)檢測(cè)。

采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分別將miR-NC、miR-106a-5p、miR-106a-5p+pcDNA或miR-106a-5p+CSF1按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)染至足細(xì)胞,隨后將細(xì)胞暴露于LN-IgG中孵育,分別將細(xì)胞設(shè)為L(zhǎng)N-IgG組、LN-IgG+miR-NC組、LN-IgG+miR-106a-5p組、LN-IgG+miR-106a-5p+pcDNA組或LN-IgG+miR-106a-5p+CSF1組。未經(jīng)處理的細(xì)胞為對(duì)照組(Control)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR): 應(yīng)用TRIzol試劑盒提取組織與足細(xì)胞中的總RNAs, 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNAs, 隨后以cDNAs為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃下2 min, 95 ℃下30 s, 60 ℃下30 s, 72 ℃下30 s, 40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法,分別以U6和GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算分子含量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn): 各組足細(xì)胞在96孔板中與10 μL CCK-8溶液室溫孵育2 h(每孔1.5×103個(gè)),測(cè)量每孔450 nm處的吸光度值(A值)以評(píng)估細(xì)胞活力。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù): 應(yīng)用PBS洗滌收集的各組細(xì)胞,洗滌2次后,在含有細(xì)胞的EP管中加入400 μL含有10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI的1×Annexin V結(jié)合緩沖液,黑暗條件下染色15 min, 在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA): 應(yīng)用離心法收集各組足細(xì)胞的上清液,將上清液與抗體混合物在ELISA板中室溫孵育1 h。洗滌后,將100 μL底物加入到每孔中,黑暗條件下孵育10 min。每孔加入100 μL終止反應(yīng)液,檢測(cè)各孔A值,計(jì)算細(xì)胞中白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。

1.2.7 Western blot: 各組足細(xì)胞與500 μL RIPA緩沖液共孵育,采用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白,隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。采用抗LC3-Ⅰ/Ⅱ (ab192890, 1∶2 000), p62 (ab109012, 1∶2 000), CSF1 (ab233387, 1∶1 000)和GAPDH(ab9485, 1∶5 000)與PVDF膜4 ℃孵育過(guò)夜, TBST洗滌后,加入二抗稀釋液(1∶3 000)室溫孵育2 h。應(yīng)用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白條帶,采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn): Starbase預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-106a-5p和CSF1存在互補(bǔ)序列。將含有互補(bǔ)序列的CSF1片段擴(kuò)增并插入pmirGLO載體構(gòu)建野生型(WT)熒光素酶載體(WT-CSF1 3′UTR)。應(yīng)用點(diǎn)突變技術(shù)突變含有結(jié)合位點(diǎn)序列片段,構(gòu)建突變型(MUT)載體(MUT-CSF1 3′UTR)。隨后將miR-106a-5p或miR-NC和WT-CSF1 3′UTR或MUT-CSF1 3′UTR共轉(zhuǎn)染至足細(xì)胞, 48 h后檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-106a-5p在LN患者及LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中低表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示,相較于健康志愿者, miR-106a-5p在LN患者中低表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1); 相較于NC-IgG組, LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中miR-106a-5p含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖1。

A: LN患者和健康志愿者miR-106a-5p相對(duì)表達(dá)(與LN患者比較, ????P<0.000 1); B: Control、NC-IgG及LN-IgG組的足細(xì)胞中miR-106a-5p含量比較(與NC-IgG比較, ???P<0.001)。

2.2 LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中miR-106a-5p過(guò)表達(dá)

相較于Control, LN-IgG刺激導(dǎo)致miR-106a-5p含量降低, LN-IgG刺激可降低細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制IL-6和TNF-α, 并導(dǎo)致自噬蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ升高以及P62蛋白含量下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001或P<0.000 1)。相較于LN-IgG+miR-NC組, LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中miR-106a-5p轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-106a-5p含量上升, miR-106a-5p過(guò)表達(dá)后LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞的細(xì)胞活力增強(qiáng),凋亡率降低, IL-6和TNF-α含量下降, LC3-Ⅱ/Ⅰ升高以及P62蛋白含量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001或P<0.000 1)。見(jiàn)圖2。

A: qRT-PCR檢測(cè)miR-106a-5p的含量; B: CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力; C: 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡; D、E: ELISA檢測(cè)IL-6和TNF-α的含量; F: Western blot 分析LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和P62的蛋白含量。與LN-IgG比較, ???P<0.001, ????P<0.000 1; 與LN-IgG+miR-106a-5p比較, ??P<0.01, ???P<0.001, ????P<0.000 1。

2.3 CSF1是miR-106a-5p的靶基因

Starbase軟件預(yù)測(cè)miR-106a-5p在CSF1上存在靶向結(jié)合位點(diǎn); 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示, miR-106a-5p mimic可顯著降低WT組熒光素酶活性(P<0.000 1), 而對(duì)突變組則無(wú)影響,提示miR-106a-5p與CSF1存在直接相互作用; 相較于健康志愿者, CSF1在LN患者中高表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1), 且CSF1含量與miR-106a-5p含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001); Western blot分析顯示,相較于NC-IgG組, LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中CSF1含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖3。

A: Starbase軟件預(yù)測(cè)miR-106a-5p在CSF1上存在結(jié)合位點(diǎn); B: 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(與miR-NC比較, ????P<0.000 1); C: qRT-PCR檢測(cè)LN患者和健康志愿者CSF1的含量(與健康志愿者比較, ????P<0.000 1); D: CSF1含量與miR-106a-5p含量呈負(fù)相關(guān); E: qRT-PCR檢測(cè)Control、NC-IgG或LN-IgG處理的足細(xì)胞中CSF1的含量(與NC-IgG比較, ???P<0.001)。

2.4 LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中CSF1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-106a-5p的功能

相較于Control, LN-IgG誘導(dǎo)CSF1含量升高,相較于LN-IgG+miR-NC組, LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中miR-106a-5p轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CSF1含量降低,相較于LN-IgG+miR-106a-5p+pcDNA組, LN-IgG+miR-106a-5p+CSF1組足細(xì)胞中CSF1含量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001或P<0.000 1)。相較于LN-IgG+miR-NC組, miR-106a-5p過(guò)表達(dá)后LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞的細(xì)胞活力增強(qiáng),凋亡率降低, IL-6和TNF-α含量下降, LC3-Ⅱ/Ⅰ升高以及P62蛋白含量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001或P<0.000 1)。相較于LN-IgG+miR-106a-5p+pcDNA組, LN-IgG+miR-106a-5p+CSF1組中足細(xì)胞的細(xì)胞活力降低,凋亡率升高, IL-6和TNF-α含量升高, LC3-Ⅱ/Ⅰ降低以及P62蛋白含量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001或P<0.000 1)。見(jiàn)圖4。

A: Western blot檢測(cè)CSF1的含量; B: CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力; C、D: 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡; E、F: ELISA檢測(cè)IL-6和TNF-α的含量; G: Western blot 分析LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和P62的蛋白含量。與LN-IgG比較, ????P<0.000 1; 與LN-IgG+miR-106a-5p比較, ???P<0.001,????P<0.000 1; 與LN-IgG+miR-106a-5p+pcDNA比較, ?P<0.05, ??P<0.01, ????P<0.000 1。

3 討 論

LN在SLE中非常普遍,約有44%的LN患者可發(fā)展為終末期腎病[12]。許多因素可促進(jìn)LN的進(jìn)展,包括激素失衡、基因突變、藥物等[13]。目前,人們對(duì)LN的確切發(fā)病機(jī)制的了解仍不完善,因此其治療進(jìn)展的研究仍然有限。研究[14-15]證實(shí)足細(xì)胞損傷在LN的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。免疫復(fù)合物(IC)的沉積及其引發(fā)的炎癥是LN腎小球損傷機(jī)制的基礎(chǔ),足細(xì)胞是LN中IC沉積的直接或間接靶點(diǎn),在不同程度LN中都可觀察到足細(xì)胞組織學(xué)損傷[15]。目前,已有多個(gè)研究表明miRNAs參與調(diào)節(jié)LN, 例如過(guò)表達(dá)miR-183可以靶向抑制TGFBR1的表達(dá),抑制LN小鼠腎纖維化和炎癥反應(yīng)[16], miR-199a通過(guò)靶向Klotho激活NF-κB通路,從而促進(jìn)LN的炎癥反應(yīng)[17]。本研究中, miR-106a-5p被發(fā)現(xiàn)在LN患者及LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中含量降低; 功能實(shí)驗(yàn)表明, LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-106a-5p后足細(xì)胞的活性增強(qiáng)、凋亡減少。促炎因子IL-6和TNF-α在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化和抗原呈遞,并調(diào)節(jié)免疫[18]。本研究證實(shí),過(guò)表達(dá)miR-106a-5p抑制LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中IL-6和TNF-α分泌,從而抑制炎癥反應(yīng)。研究[19]表明在LN小鼠模型中,在經(jīng)過(guò)α干擾素(IFN-α)和LN患者血清治療的小鼠足細(xì)胞中自噬是上調(diào)的, LN-IgG誘導(dǎo)的自噬可以保護(hù)足細(xì)胞免于凋亡。本研究證明LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中自噬增強(qiáng),且過(guò)表達(dá)miR-106a-5p后,足細(xì)胞自噬能力進(jìn)一步增強(qiáng)?？偟膩?lái)說(shuō), LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中miR-106a-5p過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞活力,抑制凋亡、炎癥以及增強(qiáng)自噬。

為了進(jìn)一步探討miR-106a-5p調(diào)節(jié)足細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制,本研究繼續(xù)探索miR-106a-5p的下游靶標(biāo),隨后證實(shí)CSF1是miR-216a-5p的功能靶標(biāo)。CSF1是巨噬細(xì)胞的主要生長(zhǎng)因子,敲除CSF1可抑制LN小鼠的狼瘡[20]。LN小鼠體內(nèi)CSF1高表達(dá),循環(huán)CSF1刺激腎內(nèi)巨噬細(xì)胞積聚,誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡,損害腎臟[21]。此外, LN患者血清或尿液CSF1水平升高,對(duì)其升高水平實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)可以預(yù)測(cè)腎臟疾病活動(dòng)和LN的發(fā)作和復(fù)發(fā)[22]。CSF1是LN的潛在治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)CSF1在LN患者及LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中高表達(dá),上調(diào)CSF1可以逆轉(zhuǎn)miR-106a-5p介導(dǎo)的足細(xì)胞活力及自噬增強(qiáng)和凋亡及炎癥抑制。

綜上所述, LN-IgG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中miR-106a-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向抑制CSF1促進(jìn)細(xì)胞活力,抑制凋亡、炎癥以及增強(qiáng)自噬, miR-106a-5p可能是延遲或緩解LN的有效治療靶標(biāo)。