參芪糖腎安膠囊含藥血清對(duì)脂多糖損傷的腎小管上皮細(xì)胞活性、超微結(jié)構(gòu)及NLR蛋白3炎性小體的作用機(jī)制

張瑞方, 高 峰, 楊 薇, 李 娟, 張軼歐, 姚吉太, 程 剛

(山西省中醫(yī)院 腎病三科, 山西 太原, 030012)

膿毒癥是ICU常見(jiàn)的全身炎癥反應(yīng)綜合征,對(duì)體內(nèi)的多種器官可造成影響,最終可發(fā)展為多器官功能衰竭及膿毒性休克[1]。急性腎損傷(AKI)是膿毒癥患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥,是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要因素[2]。研究[3]顯示,膿毒癥患者中AKI發(fā)生率為68.2%, 合并AKI患者的90 d死亡率高達(dá)35.5%, 嚴(yán)重影響患者的生命健康。膿毒癥性AKI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。研究[4]發(fā)現(xiàn), AKI是對(duì)免疫激活物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLR)及NLR形成的炎性小體,可作為固有的滿意系統(tǒng)感受器識(shí)別多種危險(xiǎn)信號(hào),通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞活化和細(xì)胞因子釋放而激活炎癥因子,進(jìn)而造成腎損傷[5]。

研究[6]發(fā)現(xiàn),在腎臟炎癥反應(yīng)中, NLR蛋白3(NLRP3)是重要的指標(biāo)之一,其可活化下游半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)信號(hào),進(jìn)而通過(guò)激活白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子造成組織損傷。參芪糖腎安具有益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎、化瘀瀉濁等作用,研究[7]證實(shí)其對(duì)早期的糖尿病腎病具有緩解癥狀、降低血糖、減少尿蛋白、改善微循環(huán)的作用。脂多糖(LPS)在臨床上又稱為內(nèi)毒素,是革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)或死亡時(shí)裂解釋放出的主要成分,其可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等加重AKI的發(fā)生[8]。本研究采用LPS誘導(dǎo)AKI體外模型,探討參芪糖腎安含藥血清對(duì)LPS損傷的腎小管上皮細(xì)胞活性、超微結(jié)構(gòu)及NLRP3炎性小體的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)); 參芪糖腎安膠囊含藥血清由黃芪、丹參、益母草、女貞子、旱蓮草、茯苓等中藥組成,由本院制劑室制備; CCK-8試劑盒(蘇州新賽美生物科技有限公司); LPS(美國(guó)Sigma公司); ELISA試劑盒(武漢華美生物有限公司); 兔抗大鼠NLRP3抗體(1∶500)、caspase-1抗體(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶2 000)(武漢艾美捷科技有限公司)。

1.2 儀器

BIORAD-550型酶標(biāo)儀(北京京科瑞達(dá)科技有限公司); BBS-V800型單人超凈臺(tái)(濟(jì)南豐盈醫(yī)療器械有限公司); SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司); CE-100型凝膠電泳儀(上海金鵬分析儀器有限公司); FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HK-2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,加入青霉素(100 U/mL)-鏈霉素(100 μg/mL)雙抗,而后將細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中, 2 d更換培養(yǎng)液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)傳代,傳代比例1∶3。取對(duì)數(shù)的HK-2細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 制備含藥血清

SPF級(jí)SD大鼠12只,雄性,體質(zhì)量200～220 g, 購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司, SYXK(京)2022-0052, 自由飲食進(jìn)水。將大鼠隨機(jī)分為空白組(n=4)和藥物干預(yù)組(n=8)。按照成人臨床用藥劑量計(jì)算,藥物干預(yù)組給予5.6 g/kg參芪糖腎安灌胃,空白組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃。每天1次,連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃給藥前大鼠均禁食8 h, 自由飲水, 30 min后取股動(dòng)脈血,靜置2 h后離心20 min, 離心速度3 000轉(zhuǎn)/min, 收集上清液于-20 ℃冰箱保存。

1.5 實(shí)驗(yàn)濃度篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HK-2細(xì)胞于含LPS的培養(yǎng)基中培養(yǎng),分為空白血清組及含藥血清組(將血清用RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)稀釋,體積分?jǐn)?shù)分別為1.00%、1.25%、2.50%、5.00%、10.00%),采用CCK-8法計(jì)算細(xì)胞存活率(%),通過(guò)計(jì)算含藥血清體積分?jǐn)?shù)確定血清實(shí)驗(yàn)濃度。

1.6 細(xì)胞處理與分組

調(diào)整HK-2細(xì)胞密度為3×103個(gè)/孔,而后接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隨機(jī)將細(xì)胞分為空白組(HK-2+75 μL 7.5%空白血清)、LPS組(HK-2+LPS+75 μL 7.5%空白血清)、低濃度組(HK-2+LPS+75 μL 2.5%含藥血清+75 μL 7.5%空白血清)、中濃度組(HK-2+LPS+75 μL 5%含藥血清+75 μL 5%空白血清)、高濃度組(HK-2+LPS+150 μL 10%含藥血清)。

1.7 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

調(diào)整HK-2細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL, 而后接種于96孔板中,采用完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中48 h,隨后于孔板的每孔中加入100 μL的CCK-8溶液,于上述相同的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h, 于450 nm波長(zhǎng)處在酶標(biāo)儀上測(cè)定各組細(xì)胞的光密度(OD)值。

1.8 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力

調(diào)整HK-2細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL,而后接種于6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h。向細(xì)胞中加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,而后與5 μL Annexin V-FITC混合并振勻,在室溫環(huán)境中避光孵育15 min,隨后與10 μL PI混合并振勻,相同條件孵育15 min; 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中,離心機(jī)3 000 轉(zhuǎn)/min離心5 min, 收集上清液于EP管中,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.10 電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

取各組HK-2細(xì)胞并用0.25%胰蛋白酶消化,離心機(jī)800 轉(zhuǎn)/min離心5 min, 加入2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)固定細(xì)胞,次日PBS清洗細(xì)胞,采用2%四氧化鋨固定細(xì)胞4 h。細(xì)胞脫水后置于丙酮中,采用環(huán)氧樹(shù)脂包埋細(xì)胞; 切片機(jī)將包埋細(xì)胞切成薄片,厚度為50 nm, 晾干切片后用醋酸鈾酰和堿性檸檬酸鉛染色,透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.11 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)細(xì)胞中NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)

采用0.25%胰蛋白酶消化各組細(xì)胞,離心細(xì)胞并收集上清液, DAB法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白濃度。配置等濃度蛋白溶液為2 μg/mL, 按照6∶1的比例加入相應(yīng)體積溶液,煮沸溶液10 min后保存蛋白溶液于-20 ℃的冰箱。取蛋白樣品30 μg, 電泳蛋白樣品后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,加入5%的脫脂奶粉到PVDF膜上,封閉PVDF膜1 h, 分別加入一抗(1∶500), 在4 ℃環(huán)境中孵育一抗過(guò)夜,而后清洗PVDF膜,加入相應(yīng)的二抗(1∶1 000), 室溫孵育二抗2 h。將ECL發(fā)光劑加入到細(xì)胞中曝光,用顯影液顯影,采用Image Lab軟件分析各條帶灰度值。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Priam8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同組間數(shù)據(jù)采用單因素方差(one-way ANOVA)分析,各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較

1.00%和1.25%的含藥血清細(xì)胞存活率與LPS組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 2.50%、5.00%、10.00%的含藥血清存活率與LPS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 且呈劑量依賴性,因此選用含藥血清濃度為2.50%、5.00%、10.00%(圖1A)。LPS組細(xì)胞存活率低于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與LPS組相比,低濃度組、中濃度組和高濃度組細(xì)胞存活率均增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 且隨著濃度的增加,細(xì)胞的存活率更高,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

A: 不同濃度含藥血清細(xì)胞存活率比較,與LPS比較, ?P<0.05; B: 各組細(xì)胞存活率比較,與空白組比較, ?P<0.05; 與LPS組比較, #P<0.05; 與低濃度組比較, △P<0.05; 與中濃度組比較, ▲P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較

與空白組相比, LPS組細(xì)胞凋亡率增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與LPS組相比,低濃度組、中濃度組和高濃度組細(xì)胞凋亡率降低,且高濃度組細(xì)胞凋亡率低于低濃度組和中濃度組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

與空白組比較, ?P<0.05; 與LPS組比較, #P<0.05; 與低濃度組比較, △P<0.05; 與中濃度組比較, ▲P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞炎癥因子水平比較

與空白組相比, LPS組細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與LPS組相比,低濃度組、中濃度組和高濃度組細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低,且高濃度組細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平低于低濃度組和中濃度組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

A: 各組IL-6水平比較; B: 各組IL-1β水平比較; C: 各組TNF-α水平比較。與空白組比較, ?P<0.05; 與LPS組比較, #P<0.05; 與低濃度組比較, △P<0.05; 與中濃度組比較, ▲P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較

與空白組相比, LPS組細(xì)胞大量壞死,胞體明顯變大,胞膜大量破裂,且胞漿內(nèi)容物大量溢出在外,細(xì)胞大量壞死; 與LPS組相比,低濃度組、中濃度組和高濃度組細(xì)胞均有明顯的改善,壞死的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,僅可見(jiàn)少量細(xì)胞線粒體輕度腫脹和空泡樣變,且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖4。

紅色箭頭為壞死細(xì)胞; 橙色箭頭為空泡樣變。

2.5 各組細(xì)胞中NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)比較

與空白組相比, LPS組細(xì)胞中NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與LPS組相比,低濃度組、中濃度組和高濃度組細(xì)胞中NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)降低,且高濃度組細(xì)胞中NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)低于低濃度組和中濃度組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

3 討 論

AKI由多種因素共同所致,主要是因腎功能在短期內(nèi)快速降低而導(dǎo)致的臨床綜合征[9]。AKI若不能進(jìn)行及時(shí)的治療,會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槁阅I功能不全,最終會(huì)發(fā)展為慢性腎衰竭。近年來(lái), AKI的細(xì)胞和分子病因機(jī)制的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,研究[10]表明炎癥、免疫反應(yīng)、腎小球內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)、腎小管周圍和腎小球微血管血流紊亂均可影響AKI的進(jìn)展,且多集中于腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)的損傷。發(fā)生膿毒癥時(shí),炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、能量代謝紊亂等作用機(jī)制均會(huì)造成RTEC損傷[11]。參芪糖腎安顆粒具有益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎、化瘀瀉濁的功效,方中黃芪具有健脾益氣的功效; 丹參具有活血通經(jīng)和祛瘀的功效; 女貞子具有補(bǔ)肝益腎滋陰的功效,旱蓮草具有滋陰益腎理血的功效,女貞子聯(lián)合旱蓮草具有補(bǔ)肝腎之陰虛、除虛熱而涼血的功效。方中藥物聯(lián)合使用具有攻補(bǔ)兼施之效,益氣養(yǎng)陰而不留邪,祛瘀化濁而不傷正,共奏健脾補(bǔ)氣、滋腎養(yǎng)陰、活血祛瘀、利水滲濕的功效。本研究采用LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞制備AKI體外模型,結(jié)果顯示LPS組細(xì)胞存活率顯著降低,凋亡率顯著增加; 參芪糖腎安含藥血清干預(yù)后HK-2細(xì)胞的存活率顯著增加,凋亡率顯著降低,且呈劑量依賴性。上述結(jié)果提示參芪糖腎安含藥血清能抑制LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡而引發(fā)的AKI。趙宗江等[12]研究證實(shí),參芪糖腎安能減輕糖尿病腎病大鼠腎臟病理?yè)p害,延緩疾病的進(jìn)程。

研究[13]發(fā)現(xiàn), AKI可由腎臟缺血-再灌注損傷、微循環(huán)障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)損傷等因素共同所致,其能通過(guò)損傷腎臟血管內(nèi)皮功能而改變血流動(dòng)力學(xué),通過(guò)形成大量的微血栓而引發(fā)AKI。當(dāng)膿毒癥發(fā)生時(shí),機(jī)體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等會(huì)通過(guò)內(nèi)毒素和病原微生物的刺激而激活,通過(guò)釋放出大量的炎癥因子而加重病情[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn), AKI的早期會(huì)有大量的炎癥介質(zhì)釋放,包括IL-6、IL-1β、TNF-α等,機(jī)體通過(guò)識(shí)別病原微生物而釋放抗炎因子和炎性標(biāo)記物,通過(guò)誘發(fā)代償性抗炎反應(yīng)綜合征而形成抗炎和促炎的動(dòng)態(tài)變化。當(dāng)機(jī)體有明顯的抗炎反應(yīng)時(shí),會(huì)通過(guò)降低機(jī)體對(duì)外界的抗打擊能力而加劇病情[16]。本研究結(jié)果顯示,LPS組細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、IL-6水平顯著增加,糖腎安含藥血清干預(yù)后HK-2細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低,且超微結(jié)構(gòu)結(jié)果證實(shí),細(xì)胞中炎性因子顯著減少,且呈濃度依賴性,提示糖腎安含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性損傷具有保護(hù)作用。張澤英等[17]研究證實(shí),可通過(guò)抑制由LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放改善膿毒癥大鼠腎臟損傷,進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用。

NLRP3炎性小體在靜止?fàn)顟B(tài)下包含ASC和pro-Caspase-1。當(dāng)機(jī)體感受到外界刺激時(shí),NLRP3會(huì)通過(guò)改變結(jié)構(gòu)而聚集AS和pro-Caspase-1, 聚集的pro-Caspase-1通過(guò)自我剪切形成具有活性的Caspase-1, 進(jìn)而通過(guò)對(duì)炎癥抑制的激活而攻擊病原體及相關(guān)組織。近年來(lái)研究[18]發(fā)現(xiàn),NLRP3可介導(dǎo)糖尿病腎病及腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展,可通過(guò)降低NLRP3的活性抑制炎性反應(yīng)來(lái)改善腎臟損傷。本研究結(jié)果顯示, LPS組細(xì)胞中NLRP3和caspase-1蛋白明顯增加,提示AKI能激活NLRP3炎性小體進(jìn)而增加caspase-1的表達(dá)。參芪糖腎安膠囊含藥血清干預(yù)后HK-2細(xì)胞中NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)明顯降低,超微結(jié)構(gòu)結(jié)果證實(shí)細(xì)胞壞死數(shù)量顯著減少,且呈濃度依賴性,提示參芪糖腎安膠囊含藥血清可通過(guò)抑制NLRP3和caspase-1降低組織損傷。

綜上所述,參芪糖腎安膠囊含藥血清可抑制LPS損傷的腎小管上皮細(xì)胞凋亡,增高細(xì)胞存活率,改善超微結(jié)構(gòu),抑制NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎性反應(yīng),對(duì)AKI發(fā)揮保護(hù)作用。