長鏈非編碼RNA-PVT1促進腎癌細胞的遷移和轉移

王 嫚, 周 潔, 嚴雪冰, 王成海, 4

(揚州大學附屬醫院, 1. 病理科, 3. 腫瘤科, 江蘇 揚州, 225009;2. 江蘇省沭陽縣中醫院 腎內科, 江蘇 沭陽, 223600;4. 揚州大學醫學院 病理教研室, 江蘇 揚州, 225009)

腎細胞癌(RCC)是世界上最致命的泌尿系統惡性腫瘤之一, 發病率和致死率逐年上升[1-2]。RCC的主要病理類型是透明細胞腎細胞癌(ccRCC), 約占所有RCC病例的75%[3]; 由于復發率或轉移率高、早期診斷困難和耐藥性[4-5], ccRCC患者的預后很差。因此迫切需要了解ccRCC的生物學機制,這有助于發現ccRCC新的生物標志物和治療靶點。近年來,長鏈非編碼RNA(LncRNA)成為癌癥和其他疾病的潛在生物標記物。LncRNA可作為致癌基因和腫瘤抑制劑,參與各種細胞信號通路[6]。在RCC中也檢測到lncRNA表達異常,其可作為診斷標志物,還可在確定預后或監測治療反應方面發揮重要作用[7-8]。研究[9]發現, Lnc-PVT1、Lnc-SLC16A1-AS1、Lnc-LINC00887和Lnc-LUCAT1在RCC中表達水平升高,但并沒有闡述Lnc-PVT1的作用機制。本文探討Lnc-PVT1(NCBI登錄號NC_000008.11)在ccRCC組織中的表達情況、臨床意義和發生機制,以期為ccRCC的臨床治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2022年12月在揚州大學附屬醫院和沭陽縣中醫院接受腎癌手術切除的69例患者作為研究對象,年齡為42～65歲,中位年齡為54歲。納入標準: ① 臨床及病理資料無缺失者; ② 經病理確診為透明細胞腎癌者; ③ 術前未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療者; ④ 對本研究知情同意者。排除標準: ① 合并其他惡性腫瘤者; ② 合并有腦轉移者; ③ 心、肝、腎功能不全者。收集69例配對的ccRCC組織和鄰近正常腎組織以及相關臨床病理資料。本實驗經醫院倫理與道德委員會批準。

1.2 質粒和細胞

Lnc-PVT1全長過表達質粒和si-Lnc-PVT1(序列1: CAGCGACAAGTTGAGACTTGTTCAA, 2: CACATCAAATCAATTCCCTGTTCTT)合成于南京金斯瑞生物科技有限公司。腎癌細胞株786-O、A498和正常腎小管上皮細胞HK2購于中國科學院上海生科院細胞庫。腎癌細胞株在RPMI-1640培養基(Life Technologies, US)中培養, HK2在DMEM培養基(Life Technologies)中培養,并添加青霉素G(100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)和10%胎牛血清(FBS, Life Technologies)。所有細胞系均在37 ℃、含5% CO2的增濕空氣中培養。通過Lipofectamine 2000細胞轉染試劑盒按試劑說明書將Lnc-PVT1mimic(模擬物)和si-lnc-PVT1(抑制物)的質粒轉染至腎癌細胞株(濃度為100 nmol/L)。基質金屬蛋白酶-9(MMP9)抗體購自美國Abcam。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)實驗

首先通過Trizol法提取ccRCC組織總RNA, 檢測RNA濃度,然后進行cDNA的反轉錄合成。反應體系: 總RNA 1 μg+mRQ Buffer(2×)5 μL+mRQ Enzyme 1.25 μL+無酶水補至10 μL, PCR儀擴增獲得cDNA產物。qRT-PCR實驗通過Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行操作,反應體系: SYBR預混料Ex Taq Ⅱ 10 μL+ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.4 μL+上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL+下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL+ CDNA模板1.6 μL+DEPC水7.2 μL, 合計20 μL。在Applied Biosystems 7500 R-T PCR system進行qRT-PCR實驗: ① 預變性 94 ℃ 5 min。② PCR反應: 94 ℃ 30 s至55 ℃ 30 s至70 ℃ 30 s, 共40個循環, 94 ℃ 1 min至 55 ℃ 30 s至95 ℃ 30 s。各引物序列如下: Lnc-PVT1上游引物5′-TTCCAGTGGATTTCCTTGCGGA-3′, 下游引物TGGTCAGGCAAGGCTTCCAGAA;GAPDH上游引物5′-ACCTGGACCTGGACCTGGACT-3′, 下游引物5′-ACCTGGACCTGGACCTGGGAT-3′。 微小RNA-145 (miR-145)使用PrimeScript RT-PCR試劑盒進行實驗,步驟按試劑說明書進行, miR-145上游為5′-ATTACACCTTGTCCTCACGGT-3′, 下游為5′-CGGATTGGTACTGGAGTTC-3′。

1.4 RNA原位分子雜交實驗(RISH)

Lnc-PVT1探針和原位雜交試劑盒購自BOSTER生物公司,探針序列5′-GCCAAAGUGAG>UGGAUCACUUGAGGUCAGGAGUUCGAGACCAACCUGGCCAACAUGGUGA-3′。實驗按試劑盒說明書進行: 將厚度4 μm切片用胃蛋白酶消化RNA核酸片段。先是預雜交,然后使用Lnc-PVT1 RNA探針進行雜交,然后H2O2封閉液后滴加抗地高辛, 1 h后滴加鏈霉親和素-生物素復合物,最后滴加生物素化過氧化物酶。使用DAB將陽性物質染成棕黃色顆粒,用蘇木素將胞核染成藍色進行對比,封片后光鏡觀察。結果判定: 細胞中出現棕黃色物質為Lnc-PVT1陽性細胞; 光鏡下隨機選擇5個高倍視野,計算陽性細胞與總細胞數的百分率。根據試劑說明書推薦,以不加探針的染色組織為空白對照。

1.5 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)

在Lnc-PVT1過表達或降低組(過表達或降低Lnc-PVT1)和Lnc-PVT1正常表達對照組(正常表達Lnc-PVT1)細胞中加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA液,冰上裂解30 min, 然后4 ℃、12 000 g離心15 min, 吸取上清、分裝,以二喹啉甲酸(BCA)方法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)采用10%分離膠、6%濃縮膠。將2×Loading Buffer添加到蛋白溶液中,在100 ℃下孵化5 min。每個上樣孔中均分別加入30 μg蛋白樣品,電泳使用70 V電壓,觀察染料到達分離膠時,調整電壓為100 V繼續電泳,觀察溴酚藍到達凝膠的下端時,終止電泳。把凝膠取出,裁剪合適大小的NC膜,放在轉移緩沖液中浸泡備用。設置200 mA恒流,冰上轉膜50 min。把NC膜置于5 %牛血清白蛋白內,于室溫環境孵育2 h。將1∶1 000一抗溶液稀釋后放入NC膜,放在4 ℃孵化12 h。最后將二抗工作液浸泡NC膜, 37 ℃結合2 h。按照顯色后分析條帶的灰度值計算蛋白表達水平。將GAPDH設置為內參。一抗為鼠源性單克隆(貨號MMP9SAB1402274-100UG, Sigma-Aldrich公司); 二抗為通用性羊抗鼠HRP(貨號C31430100, Invitrogen公司)。

1.6 Transwell遷移實驗

在Transwell小室的上室(覆有直徑8 mm膜)置入RPMI 1640培養液200 μL, 加入1×105個轉染的腎癌細胞,設3個復孔。下室內加入10%胎牛血清RPMI 1640的培養液,以便吸引上室內的腫瘤細胞穿過覆膜。將小室置入下室, 37 ℃共孵育24 h后,用棉簽去除小室上室腔里的細胞,甲醛固定40 min,再用0.1%結晶紫對小室上腔底部反面的細胞進行染色,計數遷移的腎癌細胞數目并拍照。

1.7 雙熒光素酶報告實驗

利用脂質體介導轉染腎癌細胞,同時用miR-145基因轉染相關癌細胞,觀察熒光素酶的發光情況。雙熒光素酶實驗分組情況: 主要分為MMP9-WT(野生型)組和MMP9-MUT(突變型)組。根據試劑盒說明書,再轉染后24 h檢測雙熒光活性。實驗重復3次。實驗主要步驟如下: 首先將樣本和試劑盒放置于室溫環境中。10 min后每孔加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑,再加入20 μL樣本,輕柔吹打混勻后讀數,以細胞裂解液作為對照組; 然后每孔加入100 μL海腎熒光素酶檢測試劑,使用酶標儀震蕩混勻后讀數; 數值計算: 以螢火蟲熒光素酶作為內參,將海腎熒光素酶測定得到的數值除以螢火蟲熒光素酶測定得到的數值。根據比值來檢測不同樣品間的目的報告基因激活程度。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 Lnc-PVT1在ccRCC組織和細胞中的表達

運用qRT-PCR檢測Lnc-PVT1在ccRCC組織和細胞中的表達。如圖1A所示,在69例ccRCC組織中, Lnc-PVT1的表達水平高于癌旁正常腎組織,差異有統計學意義(P<0.05)。與正常腎小管上皮細胞HK2細胞相比(圖1B), Lnc-PVT1在腎癌細胞株786-O、A498中表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明Lnc-PVT1在腎癌中發揮致癌基因的作用。

A: ccRCC組織和癌旁組織中Lnc-PVT1的表達水平(與癌旁正常組織比較, ?P<0.05); B: Lnc-PVT1在不同細胞株中的表達水平(與HK2細胞株比較, ?P<0.05)。

2.2 RISH顯示Lnc-PVT1在ccRCC中的陽性表達

在RNA水平上,運用RNA原位雜交實驗再次檢測Lnc-PVT1的表達水平。實驗結果表明,在ccRCC組織中Lnc-PVT1 RNA主要定位于細胞漿中,為棕黃色陽性染色(圖2); 在癌旁正常腎組織中很少有棕黃色染色,為陰性表達。ccRCC組織中Lnc-PVT1陽性率為73.91%(51/69), 高于癌旁正常腎組織的14.49% (10/69), 差異有統計學意義(χ2=4.128,P<0.05)。

A、C: ccRCC組織中Lnc-PVT1呈陽性表達,細胞中出現棕黃色顆粒; B、D: 癌旁正常腎組織中主要呈陰性表達。A、B: 高倍放大,倍數為400倍; C、D: 中倍放大,倍數為200倍。

2.3 Lnc-PVT1的陽性表達及其臨床病理意義

在69例ccRCC組織中,根據陽性例數,將病例分為Lnc-PVT1陽性表達組(n=51)和Lnc-PVT1陰性表達組(n=18)。Lnc-PVT1的陽性表達與病理分級和淋巴結轉移均密切相關(P<0.05), 但與患者年齡、性別、腫瘤大小和TNM分期均無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 69例ccRCC組織中Lnc-PVT1的陽性表達及其臨床病理意義

2.4 Lnc-PVT1促進ccRCC細胞遷移

在上述臨床病理意義中, Lnc-PVT1與ccRCC患者的淋巴結轉移密切相關,因此進一步通過Transwell遷移實驗加以驗證。實驗結果如圖3所示,在786-O細胞中,敲低Lnc-PVT1表達細胞的遷移數目為(23.64±3.82)個,少于對照組的(52.25±4.42)個; 而過表達Lnc-PVT1細胞的遷移數目為(86.71±7.12)個,多于對照組的(50.13±7.04)個,差異有統計學意義(P<0.05)。在A498細胞中,與對照組相比[(51.4±5.28)個],敲低Lnc-PVT1表達后的ccRCC細胞的遷移數目減少[(27.86±3.42)個]; 而過表達Lnc-PVT1細胞的遷移數目[(82.6±7.98)個]多于對照組[(53.65±6.12)個],差異有統計學意義(P<0.05)。

A: 遷移實驗圖; B: 遷移實驗柱形圖。兩者比較, ?P<0.05。

2.5 Lnc-PVT1調控miR-145表達及其相互關系

通過生物信息學(http://www.mircode.org/download.php/miRcode Highly conserved microRNA families)預測Lnc-PVT1的下游miRNA, 結合位點基因包括miR-145(miR-145-5p)、miR-194、miR-214、miR-23、miR-29、miR-383 和miR-455。然后根據qRT-PCR實驗結果發現,過表達Lnc-PVT1后, miR-145表達水平下降(圖4A); 降低Lnc-PVT1表達后, miR-145表達水平升高(圖4B), 差異有統計學意義(P<0.05)。其余miRNAs均沒有出現顯著變化(P>0.05)。說明Lnc-PVT1僅能調控miR-145的表達。

A: 過表達Lnc-PVT1后miR-145的表達水平下降; B: 降低Lnc-PVT1表達后miR-145的表達水平升高,與NC(對照組)相比, ?P<0.05。

根據qRT-PCR實驗結果, ccRCC組織(n=69)中miR-145表達水平低于癌旁正常組織,差異有統計學意義(P<0.05); Pearson分析顯示, Lnc-PVT1與miR-145的表達呈負相關(r=-0.031 5,P<0.05)。見圖5。

A: qRT-PCR顯示在69例ccRCC組織中miR-145表達水平下降(與癌旁正常組織比較, ?P<0.05); B: Pearson相關性分析得出Lnc-PVT1與miR-145呈負相關。

2.6 MMP9是miR-145的直接靶目標

通過TargetScan和miRNAbase信息分析miR-1145靶向的下游編碼RNA, 得出MMP9 3′UTR中有miR-145互補的基因結合位點(圖6A、6B)。通過雙熒光素酶報告基因實驗(圖6C)得出在MMP9 3′UTR野生型轉染組中,與對照組相比,高表達的miR-145可抑制熒光素酶的熒光活性,差異有統計學意義(P<0.05); 在突變組miR-145中,因未能結合MMP9 3′UTR, 就不能抑制熒光素酶的活性,差異無統計學意義(P>0.05)。因此miR-145與MMP9為特異性結合。MMP9 3′UTR是miR-145的直接結合位點, miR-145通過與MMP9的3′UTR結合對MMP9蛋白質的翻譯起抑制作用。

A: 生物信息學預測MMP9 3′UTR(86-80位)與miR-145種子序列(3-9位)有互補的結合位點; B: PGL4質粒與野生型(WT)或突變型(MUT) MMP9 3′UTR的示意圖; C: 在MMP9 3′UTR 野生型轉染組,高表達miR-145可抑制熒光素酶活性,而在MMP9 3′UTR突變組中, miR-145因沒有結合位點,故不能抑制熒光素酶活性,與NC(對照組)比較, ?P<0.05。

2.7 Lnc-PVT1對腎癌細胞中miR-145/MMP9信號通路和遷移的影響

改變Lnc-PVT1和miR-145表達后,觀察MMP9蛋白的變化及對遷移能力的影響。實驗分為7個組,即對照組(NC)、過表達Lnc-PVT1組、敲低Lnc-PVT1表達組、過表達Lnc-PVT1組+過表達miR-145組、敲低Lnc-PVT1表達組+敲低miR-145表達組、過表達 Lnc-PVT1組+敲低miR-145表達組和敲低Lnc-PVT1表達組+過表達miR-145組。Lnc-PVT1能抑制miR-145表達,促進MMP9蛋白表達,在功能上也能促進腎癌細胞的遷移能力。見圖7、表2。

表2 回復實驗中遷移數目、miR-145表達和MMP-9蛋白水平變化

A: 過表達miR-145可抑制Lnc-PVT1對腎癌細胞遷移的促進作用,降低miR-145表達后可進一步激活癌細胞的遷移能力; B: 各組中miR-145相對表達量; C: Western blot檢測各組中MMP-9蛋白水平。1: 過表達Lnc-PVT1組; 2: 敲低Lnc-PVT1表達組; 3: 過表達Lnc-PVT1組+過表達miR-145組; 4: 敲低Lnc-PVT1表達組+敲低miR-145表達組; 5: 過表達 Lnc-PVT1組+敲低miR-145表達組; 6: 敲低Lnc-PVT1表達組+過表達miR-145組。與NC(對照組)比較, ?P<0.05。

3 討 論

ccRCC是最為常見的泌尿系統惡性腫瘤,腎切除術后的轉移和復發率很高,轉移性ccRCC患者的5年生存率為12%[1]。盡管靶向治療和免疫療法獲得了較大進步,但轉移性ccRCC患者的生存率并沒有提高[10]。LncRNA被認為是調節腫瘤轉移相關機制的新因素[11]。通過研究LncRNA在腎癌發生發展中的作用,尋找新的生物標志物,對于預測進展、轉移風險和治療腎癌都有積極意義[12]。

LncRNA在ccRCC的發生發展中起著至關重要的作用,一些致癌性LncRNA在ccRCC中表達水平上調,而一些抑癌性LncRNA則表達水平下調。例如,在促進腫瘤進展方面, LncRNA DARS-AS1可通過螯合miR-194上調DARS的水平,從而導致ccRCC的惡性進展[13]。LINC00511通過調節miR-625/Cyclin D1信號傳導,加速ccRCC細胞增殖并抑制細胞周期停滯在G0～G1期[14]。LncRNA FTX在ccRCC中異常上調,通過吸收miR-4429來誘導UBE2C的表達,從而促進ccRCC的生存、遷移和侵襲[15]。在抑制腫瘤進展方面, LncRNA LET在ccRCC組織和細胞中下調,通過直接與miR-373-3p結合以降低dickkopf-1和TIMP2的水平,介導腫瘤抑制[16]。在ccRCC組織中, LncRNA TCL6水平降低,通過與miR-155相互作用影響Src/Akt途徑抑制ccRCC轉移[17]。LncRNA NBAT1表達水平顯著降低,并通過NBAT1/miR-346/GSK-3β軸抑制ccRCC細胞增殖和轉移[18]。

本研究利用人類LncRNA表達譜測序分析得到ccRCC中差異表達的LncRNA[9], 并通過qRT-PCR實驗和RISH實驗驗證了Lnc-PVT1在ccRCC組織和細胞中表達升高(陽性)。故選擇Lnc-PVT1作為研究對象。本研究分析Lnc-PVT1表達與臨床病理資料的關系,發現Lnc-PVT1表達與腫瘤分化(分級)、淋巴結轉移密切相關,說明Lnc-PVT1表達越高, ccRCC級別越低,惡性程度越高,腫瘤細胞越容易通過淋巴結轉移,這也反映了患者的預后越差。

本研究進一步通過生物信息學和雙熒光素酶報告實驗證實, miR-145是Lnc-PVT1的下游靶基因。qRT-PCR實驗表明,在ccRCC中miR-145表達水平下調,在RNA水平上Lnc-PVT1高表達和miR-145低表達為負相關; 改變Lnc-PVT1的表達水平, miR-145隨之發生改變,說明Lnc-PVT1以直接或間接的方式調控miR-145的表達,至于Lnc-PVT1如何調控miR-145的機理本研究沒有深入探討,是否和其他的LncRNA發揮對microRNA海綿作用有待于將來進一步證實。miR-145一般在惡性腫瘤組織中表達水平下調,發揮腫瘤抑制基因的作用[19-20], 本研究結果也同意上述觀點,即在腎癌中發揮抑癌作用。

惡性腫瘤細胞在遷移和轉移的過程中能合成大量的細胞外基質降解蛋白酶,其主要是基質金屬蛋白酶(MMP), 使得鄰近的基質成分裂解,然后腫瘤細胞逐步遷移和轉移[21-22]。MMP9是MMP常見的亞型之一,在腫瘤組織中表達水平升高[23], 能降解細胞外基質,促進腫瘤細胞的侵襲遷移和轉移[22-24]。本研究發現, Lnc-PVT1抑制miR-145表達后,解除了miR-145對MMP9的抑制作用,從而增加了MMP9蛋白的含量,使得腫瘤細胞外基質得到降解,從而導致腎癌細胞通過增大的基質間隙,鄰近入侵并向遠處轉移,這一結果也說明MMP9會被不同的上游信號分子激活,從而促進癌細胞遷移和轉移, MMP9參與了遷移和轉移過程,與文獻[22-24]報道相一致。

綜上所述, Lnc-PVT1在ccRCC組織和細胞株中表達水平升高, Lnc-PVT1通過下調miR-145表達后增加了MMP9的表達水平,從而促進腎癌細胞的遷移和轉移,這為研究ccRCC遷移和轉移機制提供了一條新的信號通路,即Lnc-PVT1/miR-145/MMP9通路。本研究為治療轉移性腎細胞癌提供了可能的分子靶點和依據。但本研究仍存在不足之處,比如沒有探討Lnc-PVT1是否影響腎癌細胞周期和細胞凋亡,對于Lnc-PVT1如何調控miR-145未進行探究。