腦脊液宏基因組二代測序對臨床高度疑似顱內感染病原學診斷的價值

張業鵬,毛宇徑,謝佳豐,徐東,姜毓敏,張孌孌

(鄭州大學第一附屬醫院 急診重癥監護室,河南 鄭州 450000)

顱內感染是由各種病原體侵犯腦實質、腦膜等引起的嚴重中樞神經系統感染性疾病[1],目前常見病原體包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲等,可見于成人及兒童,具有高發病率及死亡率,尤其對于顱腦術后患者,繼發顱內感染可增加患者住院時間及住院花費,對患者預后有不利影響[2]。顱內感染患者的臨床表現常為非特異性,可表現為頭痛、發熱、惡心、嘔吐、抽搐等,重癥者可出現意識障礙、呼吸衰竭或循環衰竭等等[3]。對于顱內感染患者,由于腦脊液載菌量較少,因此傳統腦脊液細菌培養檢測周期長、陽性率較低且對于病毒、真菌及厭氧菌感染常不能得出有利于臨床治療的結果。對顱內感染患者病原學進行早期診斷可為臨床抗感染藥物的針對性選擇和改善患者預后提供幫助。因此,宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)技術應運而生,且mNGS以其“高通量優勢”可明顯提高顱內感染患者病原體檢出率及縮短其診斷時間,為更好地指導臨床抗生素應用提供了可能[4],且理論上根據其檢測特性,對所有具有基因組的病原體均有被檢出可能。因此,在臨床上頗為推廣,但其對于腦脊液的各類病原體的檢測特異度及靈敏度仍需進一步研究及探討[5]。本研究通過對30例腦脊液病原體宏基因測序的研究,探討mNGS在高度疑似顱內感染患者診斷中的潛在應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究符合倫理學要求,并通過鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準(倫理號2022-KY-1059-002)。回顧性分析2021年9月1日至2022年10月31日就診于鄭州大學第一附屬醫院急診重癥監護室的30例高度疑似顱內感染患者的病例資料,其中重度顱腦損傷后行“顱內血腫清除術、去骨瓣減壓術”后患者19例,蛛網膜下腔出血行“顱內動脈瘤栓塞術、腰大池引流術”后患者5例,考慮原發性顱內感染無手術患者6例。其中送取腦脊液男24例,女6例。詳細記錄30例患者的性別、年齡,在留取患者腦脊液標本前及標本后24 h內,分別獲取外周血常規、血糖、腦脊液檢驗及其他輔助檢查結果。顱內感染診斷按照《神經外科中樞神經系統感染診治中國專家共識(2021版)》中顱內感染的診斷標準[6],診斷依據如以下標準。(1)核心體溫≥38 ℃或<36 ℃,意識及精神狀態下降;伴有頭痛、惡心嘔吐、視盤水腫等顱內高壓癥狀;頸項僵硬,神經狀態受損,有膿性腦脊液流出的證據。(2)腦脊液渾濁、黃色或呈膿性,腦脊液白細胞計數>100×106L-1、中性粒細胞百分比>70%、蛋白質增加(>45 mg·dL-1)和葡萄糖水平降低(<2.2 mmol·L-1)或腦脊液葡萄糖/血糖比值<0.4。(3)在無癥狀的情況下,具有正常葡萄糖、蛋白質和細胞計數水平的陽性腦脊液培養物或革蘭氏染色被視為污染。納入標準:年齡>14歲;臨床高度懷疑顱內感染;通過腰椎穿刺術留取腦脊液行mNGS檢測及常規微生物培養。排除標準:腰椎穿刺或腰大池引流無腦脊液流出;患者家屬拒絕行腦脊液mNGS或常規微生物培養任何一項。

1.2 研究方法

1.2.1腦脊液標本留取

嚴格無菌下操作、取腦脊液(腰椎穿刺術留取)10 mL左右,其中取5 mL送腦脊液常規、生化檢查,余5 mL分別送檢細菌培養及mNGS,送檢腦脊液至微生物結果出來時間為檢測時間。

1.2.2傳統微生物培養

通過腰椎穿刺術或患者腦脊液,分別接種于血瓊脂平板、巧克力平板行細菌培養,接種于念珠菌顯色平板、沙式葡萄糖瓊脂培養基平板行真菌培養,分枝桿菌培養系統進行分枝桿菌培養。

1.2.3腦脊液mNGS

選取留取的腦脊液3～5 mL,依次對其進行片段化處理、核酸提取、提取物質控、文庫制備、上機檢測,以及人源序列去除等,最終得出有效數據。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 一般資料

高度疑似顱內感染患者共30例,共送腦脊液標本30例,男24例,女6例,年齡37～84歲,顱內感染患者17例,無顱內感染患者13例,顱內感染與無顱內感染兩組年齡、外周血白細胞、中性粒細胞百分比、降鈣素原差異無統計學意義(P>0.05),腦脊液中有核細胞數、糖、氯化物、總蛋白差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 顱內感染與無顱內感染患者一般資料比較

2.2 mNGS與常規培養對顱內感染診斷的特異度、敏感度比較

共30例樣本,mNGS陽性結果13例,與顱內感染診斷相符合10例,3例與顱內感染診斷不符,陰性結果17例,陰性結果中與顱內感染診斷不相符10例,與臨床診斷相符合7例,mNGS對總體顱內感染的特異度為76.92%,靈敏度為58.52%;常規微生物培養有3例陽性結果,培養結果均為細菌,且均與顱內感染診斷相符合,陰性結果27例,與顱內感染診斷不相符14例,與顱內感染診斷相符合13例,對顱內感染的特異度為100.00%,靈敏度為17.65%。見表2。腦脊液mNGS總體檢測陽性率(43.33%)高于常規培養法(10.00%),差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 mNGS對顱內感染的診斷價值

2.3 檢測時間

mNGS檢測時間為36.3(26.85,38.40)h,低于常規培養的104.2(91.75,118.70)h,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 檢測微生物種類

在mNGS陽性結果中:細菌檢出分別為肺炎克雷伯菌3例,鮑曼不動桿菌1例,糞腸球菌3例,銅綠假單胞菌2例,嗜麥芽窄食單胞菌3例,單核細胞增生李斯特菌1例,沙雷氏菌1例,加德納菌1例;病毒檢出分別為單純皰疹病毒4例,人類皰疹病毒2例,巨細胞病毒2例,淋巴隱病毒1例,人類細小病毒1例,細環病毒1例;另檢出曲霉菌2例,毛滴蟲1例。常規培養檢出糞腸球菌1例,鮑曼不動桿菌1例,銅綠假單胞桿菌1例,均符合顱內感染臨床診斷及與mNGS結果相符合。

3 討論

顱內感染可發生于各種免疫力低下及顱腦術后患者,顱內感染的發生明顯增加了患者住院時間及其住院花費[7],對于發生或者高度疑似顱內感染患者,由于顱內血腦屏障保護作用,細菌、真菌及病毒在腦脊液的數量較血液中明顯降低[8-10],限制了其培養的陽性率,因此對于顱內感染中病原體的鑒別一直為臨床難解之題[11],尤其對于無癥狀感染者診斷難度更高[12],而臨床廣泛應用的常規細菌培養其培養周期長且能培養菌種有限,常不能從病原體上確診,直接影響顱內感染治療中抗生素的早期選擇及患者早期病情轉歸。mNGS是一種基因層面的非培養性技術,能夠快速全面地檢測病原體。大量研究表明,mNGS具有更高的病原體鑒定特異性,且其受抗生素應用影響較小,但在應用時易被干擾[13-14]。

本研究結果顯示mNGS檢測總體陽性率高于常規細菌培養,且其研究周期較常規培養短,對病原體篩檢速度領先于常規細菌培養,為臨床醫生的更加精準化治療提供了一個更為快速、高效的診斷思路。這與Lin等[15]研究發現mNGS可以幫助臨床醫生制定更合理的用藥方案、降低患者的用藥強度、減少藥物的種類、同時改善中樞神經系統感染患者預后的作用相類似。在臨床常用實驗室指標方面,本研究結果表明,腦脊液常規、生化及外周血炎癥指標變化對mNGS陽性的預測均無特異性。因此,如果從腦脊液常規、生化結果預測顱內感染病菌的傾向性仍需后續大數據研究支持。外周血指標與患者全身狀況及感染狀況息息相關,對顱內感染無特異性預測價值,這與目前大多研究[16-17]相符。腦脊液常規、生化在兩組間差異無統計學意義。這可能與納入患者包含顱腦外傷患者相關。顱腦外傷后腦脊液中紅細胞明顯增加,干擾腦脊液中常規細胞計數表達及腦脊液中蛋白質、離子表達相關。需結合患者臨床表現綜合分析方能診斷。這與Fu等[18]對腦室外引流及蛛網膜下腔出血后顱內感染患者診斷困難,需進一步融合指標建立對于顱內感染的預測模型一致。本研究顯示,mNGS及常規培養對顱內感染的特異度及靈敏度差異有統計學意義,mNGS靈敏度較常規培養組高,但其特異度較常規培養組低,考慮與mNGS因其具有無靶病原檢測的特性,理論上可檢測樣本中所有微生物信息,也可能出現檢出多種病原體但無法確定致病病原體或無法確定是否與臨床相符的情況[19]相關,mNGS高檢出率導致無顱內感染組假陽性較高,從而導致特異度較常規培養組低,因此臨床應用中仍需進一步關注。但常規培養病原微生物檢出率低,且特殊病原體如真菌、結核等均不易檢出。因此,mNGS對于顱內感染有一定診斷價值而常規培養未表現出明顯的診斷價值。另外,與常規培養相比,mNGS對于真菌及寄生蟲亦具有較高檢出率。本研究也詳細分析了顱內感染常見病原體種類,其中銅綠假單胞菌、糞腸球菌及嗜麥芽窄食單胞菌均檢出率較高,且對鮑曼不動桿菌的檢出與臨床相符性極高,為臨床經驗性用藥提供新思路。

4 結論

mNGS在臨床的應用是值得推廣的,但由于其價格較昂貴,限制了臨床上的廣泛重復應用。本研究可為臨床顱內感染的患者治療提供一定方向。但由于本研究納入病例數有限,仍需進一步擴充病例來為臨床醫生的更加精準化治療提供新思路。