整合高通量數(shù)據(jù)探討非小細(xì)胞肺癌組織中微小RNA-182-5p的潛在靶基因

楊達(dá)平,黃婉英,羅嘉嫄,何娟

(1.廣西貴港人民醫(yī)院/廣西醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院 病理科,廣西 貴港 537100;2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科,廣西 南寧 530021)

微小RNA(microRNA,miRNA)是一種具有調(diào)節(jié)功能內(nèi)源性的非編碼RNA[1-2]。miR-182-5p是miRNA家族中重要的一員,既往研究表示miR-182-5p在胰腺癌、腸癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài),且其高表達(dá)是患者預(yù)后的不良因素[3-4]。肺癌在全球范圍內(nèi)每年造成近179萬人死亡,在腫瘤相關(guān)死亡中排首位[5]。80%的肺癌可以歸類為非小細(xì)胞癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[6]。研究顯示,盡管化療、放療、靶向治療等在肺癌領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用,患者的5 a生存率有所上升,但僅有少數(shù)早期肺癌患者在確診時(shí)可接受根治性手術(shù),所以肺癌患者總體生存率依然不高[7]。因此,探索新的生物標(biāo)志物對(duì)肺癌的診治及改善肺癌患者預(yù)后尤為重要。雖然既往研究已表明miR-182-5p在NSCLC中呈高表達(dá)狀態(tài)[8-10],但存在以下不足:如大部分研究使用單一的檢測方法;大部分研究基于單研究中心的數(shù)據(jù);部分研究使用了高通量技術(shù),由于大數(shù)據(jù)的飛速增長[11-12],miR-182-5p在NSCLC中的表達(dá)需要更新;既往研究揭示的miR-182-5p靶基因有限[13-15],但miRNA潛在靶基因眾多,仍需進(jìn)行深入研究。因此,本研究整合了多中心的大樣本數(shù)據(jù),嘗試探索miR-182-5p在NSCLC中的表達(dá)情況及該分子在NSCLC的潛在靶基因,并探討miR-182-5p在NSCLC中的臨床意義以及潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 高通量技術(shù)檢測miR-182-5p在NSCLC樣本中的表達(dá)

在GEO、ArrayExpress、SRA、Oncomine、TCGA以及各種文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫使用以下檢索詞獲得RNA測序及基因芯片等相應(yīng)高通量數(shù)據(jù):(cancer or carcinoma or adenocarcinoma or tumor) and (lung or pulmonary or respiratory or NSCLC)。檢索時(shí)間范圍為2021年12月22日前。納入標(biāo)準(zhǔn)為:(1)癌癥組樣本病理診斷為NSCLC;(2)每個(gè)芯片需包含NSCLC組和非癌對(duì)照組;(3)提供miR-182-5p的表達(dá)數(shù)據(jù);(4)物種為人類。排除標(biāo)準(zhǔn)為:(1)用于分析的NSCLC樣本或?qū)φ战M樣本數(shù)量小于3例;(2)細(xì)胞系樣本;(3)體液等非組織樣本。將所獲得的各個(gè)數(shù)據(jù)集的miRNA表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2(x+ 1)變換,繼而運(yùn)用limma軟件包[16]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。運(yùn)用R語言(v4.1.0),將相同平臺(tái)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并、去除批次效應(yīng)(借助SVA軟件包[17])后組成合并數(shù)據(jù)集。例如,將GPL11154平臺(tái)下的GSE110907和GSE175462數(shù)據(jù)集重組后的合并數(shù)據(jù)集命名為GPL11154合并數(shù)據(jù)集。獲取以上高通量數(shù)據(jù)后,將miR-182-5p表達(dá)值提取備用。在R語言(v4.1.0)中,采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)比兩組間的miR-182-5p表達(dá)水平差異,P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 其他技術(shù)檢測miR-182-5p在NSCLC樣本中的表達(dá)

除高通量技術(shù)外,逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、印跡雜交檢測、原位雜交及擴(kuò)增克隆測序等技術(shù)也可以對(duì)組織內(nèi)的miRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。在多個(gè)數(shù)據(jù)庫中檢索2021年12月22日之前的報(bào)道并提取其中的miR-182-5p表達(dá)值及病例數(shù),這些數(shù)據(jù)庫包括PubMed、Cochrane Central Register of Controlled Trials、Web of Science、Google Scholar、EMBASE、Ovid、LILACS、Wiley Online Library、中國知網(wǎng)、重慶維普、萬方數(shù)據(jù)及中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫。英文檢索詞: (cancer or carcinoma or adenocarcinoma or tumor) and (lung or pulmonary or respiratory or NSCLC) and (miR-182 or miRNA-182 or microRNA-182 or miR182 or miRNA182 or microRNA182 or miR 182 or miRNA 182 or microRNA 182 or miR-182-5p or miRNA-182-5p or microRNA-182-5p)。中文檢索詞:肺癌和miR-182-5p。納入文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)同高通量技術(shù)部分描述。

1.3 miR-182-5p在NSCLC樣本中表達(dá)的整合分析

為了獲取NSCLC中全面的miR-182-5p表達(dá)情況,將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化均值差(standard mean difference,SMD)的計(jì)算以及繪制綜合受試者工作特征(summary receiver operator characteristic,SROC)曲線。使用R語言(v4.1.0)計(jì)算SMD及95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)。使用I2統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)法進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn),當(dāng)研究存在顯著異質(zhì)性(I2>50%或P<0.1)時(shí),使用隨機(jī)效應(yīng)模型,否則使用固定效應(yīng)模型。同時(shí),R語言(v4.1.0)還被用于繪制敏感性分析森林圖以及檢測發(fā)表偏倚的漏斗圖(P>0.1提示未發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)表偏倚)。使用Stata 15.0軟件繪制評(píng)估m(xù)iR-182-5p在NSCLC中的潛在診斷效能的SROC曲線、敏感度及特異度森林圖。miR-182-5p在NSCLC中的潛在診斷效能根據(jù)曲線下面積(area under the curve,AUC)分為低效能(>0.5～0.7)、中效能(>0.7～0.9)及高效能(>0.9～1.0)。

1.4 miR-182-5p靶基因的預(yù)測及功能分析

使用miRWalk 3.0在線預(yù)測工具進(jìn)行靶基因的預(yù)測,選取總評(píng)分≥1的基因作為預(yù)測靶基因。同時(shí),課題組前期通過全面收集GEO、ArrayExpress、SRA和Oncomine等高通量數(shù)據(jù)庫,收集包含肺腺癌(115個(gè)數(shù)據(jù)集)、肺鱗癌(98個(gè)數(shù)據(jù)集)和非癌對(duì)照肺樣本基因表達(dá)矩陣的基因芯片和測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行SMD計(jì)算。基于肺腺癌數(shù)據(jù)集,具有SMD<0及其95% CI不包含0的基因被鑒定為肺腺癌低表達(dá)基因,并以相同方法篩選肺鱗癌低表達(dá)基因。肺腺癌低表達(dá)基因與肺鱗癌低表達(dá)基因交集所得的基因即為NSCLC低表達(dá)基因。因miR-182-5p在NSCLC中呈增高的趨勢(shì),本研究將預(yù)測獲得的靶基因與NSCLC中低表達(dá)基因進(jìn)行交集,縮小miR-182-5p在NSCLC中特異的潛在靶基因的范圍。借助R語言(v4.1.0)的clusterProfiler軟件包[18]對(duì)預(yù)測的潛在靶基因進(jìn)行基因體論(gene ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,同時(shí)使用該程序包進(jìn)行可視化。使用網(wǎng)絡(luò)在線工具STRING (https://string-db. org)對(duì)miR-182-5p的潛在靶基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI)。基于課題組前期準(zhǔn)備的NSCLC相關(guān)的GPL6244測序數(shù)據(jù)集(包含LUAD-GSE31552、LUAD-GSE43458、LUSC-GSE30979、LUSC-GSE31552、LUSC-GSE44077以及LUSC-GSE50627數(shù)據(jù)集),運(yùn)用Spearman相關(guān)系數(shù)的ρ值評(píng)估m(xù)iR-182-5p與潛在靶基因與的表達(dá)相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 miR-182-5p在NSCLC組織中的整合SMD

共有20個(gè)源自GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集被納入本研究(圖1)。經(jīng)過合并相同平臺(tái)的數(shù)據(jù)集,最終形成17個(gè)數(shù)據(jù)集,含1 090例NSCLC及630例非癌肺組織樣本。另外課題組使用RT-qPCR檢測125例NSCLC組織及對(duì)應(yīng)非癌肺組織miR-182-5p表達(dá)數(shù)據(jù)亦納入分析[11]。在分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的9個(gè)數(shù)據(jù)集中,與對(duì)照組織相比,miR-182-5p表達(dá)在LUAD組織和LUSC組織中均高表達(dá)(P<0.05),RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明miR-182-5p在NSCLC中表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖2。此外,對(duì)各個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了SMD計(jì)算,以綜合探討miR-182-5p在NSCLC中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,基于715例LUAD樣本和380例對(duì)照樣本,miR-182-5p在LUAD中表達(dá)上調(diào)[SMD=1.35(0.71～1.98)];基于250例LUSC樣本和125例正常肺組織樣本,miR-182-5p在LUSC中表達(dá)升高[SMD=1.31(0.54～2.08)]。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了miR-182-5p在NSCLC中表達(dá)水平升高的現(xiàn)象[SMD=1.44(1.16～1.71)]。綜合上述結(jié)果以及總SMD結(jié)果[(SMD=1.33(0.93～1.74)],與對(duì)照組相比,miR-182-5p在NSCLC組中高表達(dá),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 miR-182-5p在NSCLC中表達(dá)數(shù)據(jù)集獲取流程圖

圖2 miR-182-5p在NSCLC組織及其對(duì)照組織中的表達(dá)量

A中森林圖表明LUAD組、LUSC組及NSCLC組的miR-182-5p表達(dá)水平比各自對(duì)照組更高;B中敏感性分析提示剔除任何一個(gè)數(shù)據(jù)集后SMD仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明森林圖的SMD結(jié)果穩(wěn)健;C中漏斗圖提示未發(fā)現(xiàn)SMD結(jié)果存在明顯的發(fā)表偏倚。

2.2 miR-182-5p 在NSCLC組織中的ROC曲線和SROC曲線分析

18個(gè)數(shù)據(jù)集(含RT-qPCR)ROC曲線的AUC大小不一,表明miR-182-5p表達(dá)水平在不同數(shù)據(jù)集分析結(jié)果中顯示出不同的NSCLC診斷效能(圖4)。其中AUC>0.9的數(shù)據(jù)集有7個(gè),分別是LUAD-GPL11154、LUAD-GSE51853、LUAD-GSE74190、LUSC-GSE16025、LUSC-GSE19945、LUSC-GSE51853以及LUSC-GSE74190,表明miR-182-5p具有顯著地區(qū)分NSCLC組織和正常肺組織的效能。為了驗(yàn)證這一結(jié)果,繪制了SROC曲線。結(jié)果顯示,miR-182-5p表達(dá)水平展示出很強(qiáng)的鑒別LUAD[AUC=0.95(0.92～0.96);敏感度和特異度均≥0.79](圖5A)、LUSC[AUC=0.95(0.93～0.97);敏感度和特異度均≥0.86](圖5B)兩種NSCLC與正常肺組織的能力。基于LUAD、LUSC數(shù)據(jù)集與RT-qPCR的總SROC也支持了miR-182-5p的表達(dá)水平具有很強(qiáng)地區(qū)分NSCLC的能力[AUC=0.95(0.93～0.97);敏感度和特異度均≥0.81](圖5C)。綜上,無論是單純的LUAD亞組、LUSC亞組,還是總體NSCLC,miR-182-5p的表達(dá)水平均顯示出顯著的NSCLC診斷效能。

圖4 miR-182-5p在NSCLC組織中的表達(dá)ROC曲線以及曲線下面積

A為miR-182-5p區(qū)分LUAD與非癌肺組織的能力;B為miR-182-5p區(qū)分LUSC與非癌肺組織的能力;C為miR-182-5p區(qū)分NSCLC與非癌肺組織的能力。

2.3 miR-182-5p在NSCLC中的潛在靶基因篩選

經(jīng)SMD計(jì)算,篩選出5 683個(gè)LUAD低表達(dá)分子以及5 703個(gè)LUSC低表達(dá)分子(SMD<0,95% CI不包含0)。通過miRWalk 3.0在線工具預(yù)測獲取了5 122個(gè)預(yù)測靶基因。此外,基于NSCLC的RNA-Seq數(shù)據(jù)集篩選出1 869個(gè)miR-182-5p的負(fù)表達(dá)相關(guān)分子(Spearmanρ<-0.2,P<0.05)。將NSCLC低表達(dá)分子(即LUAD低表達(dá)分子和LUSC低表達(dá)分子)、預(yù)測靶基因以及miR-182-5p負(fù)表達(dá)相關(guān)分子取交集,獲得165個(gè)miR-182-5p在NSCLC中的潛在靶基因(圖6A)。

A為miR-182-5p潛在靶基因篩選;B為EPS15是Lysosome通路相關(guān)基因所組成的PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因;C為miR-182-5p與EPS15表達(dá)存在負(fù)相關(guān);D為潛在靶基因的GO功能分析;E為潛在靶基因的KEGG通路富集分析。

2.4 miR-182-5p在NSCLC中的潛在靶基因的潛在生物學(xué)作用及信號(hào)通路

將165個(gè)miR-182-5p的潛在靶基因進(jìn)行GO聚類分析以及KEGG通路分析,按照P值升序?qū)O的生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)以及KEGG通路分別進(jìn)行排序,其中BP、CC、MF、KEGG各種富集方式排名首位的條目分別是negative regulation of cellular protein localization、endocytic vesicle、Sh3 domain binding及Lysosome信號(hào)通路(表1、圖6D、圖6E)。

表1 miR-182-5p潛在靶基因的各分類富集分析中顯著的前5項(xiàng)條目

2.5 Endocytosis信號(hào)通路中基因與miR-182-5p的關(guān)系

選擇富集到KEGG結(jié)果排名第一的Endocytosis(內(nèi)吞作用)通路的基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,其中9個(gè)蛋白中,EPS15最有可能為PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因(圖6B)。據(jù)GPL6244測序數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果,miR-182-5p與EPS15表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性(ρ=-0.235,P=0.001)(圖6C),提示EPS15很有可能是miR-182-5p的潛在靶基因。由此推斷,miR-182-5p可能通過靶向EPS15而參與細(xì)胞內(nèi)吞作用。

3 討論

長期以來,肺癌的死亡病例未見明顯下降,其死亡病例更是一直遠(yuǎn)高于其他腫瘤[5],致使該病成為威脅人類健康的重要因素。隨著多種治療手段如化療、放療、靶向治療等在臨床中逐漸得到廣泛應(yīng)用,肺癌患者的5 a生存率有所上升。然而,確診延誤、晚期治療手段受限等問題導(dǎo)致肺癌患者總體生存率未得到明顯改善[7],仍需探尋新的思路以提高對(duì)該病的診治水平。NSCLC是最常見的肺癌病理亞型,占肺癌病例的80%,故聚焦于NSCLC的研究顯得尤為重要。此前,miR-182-5p在多種腫瘤中顯示出重要的臨床意義,但其在NSCLC的表達(dá)水平及臨床意義尚存爭議。因此,本研究旨在探討miR-182-5p在NSCLC中的表達(dá)水平、潛在的臨床意義和分子機(jī)制,從而挖掘可能有助于NSCLC診治的新生物標(biāo)志物,為改善NSCLC乃至肺癌患者的預(yù)后提供新的思路。

miR-182-5p在NSCLC中高表達(dá),且具有區(qū)分NSCLC組織和正常肺組織的能力。既往的大多數(shù)研究提示,與對(duì)照組織相比,miR-182-5p在NSCLC組織的表達(dá)水平上調(diào)[8-10]。然而,亦有報(bào)道提示與非轉(zhuǎn)移性NSCLC細(xì)胞對(duì)比,轉(zhuǎn)移性NSCLC細(xì)胞中可檢測到miR-182-5p的低表達(dá)狀態(tài)[19]。由此可見,有必要通過分析源自多中心的大樣本數(shù)據(jù)來明確miR-182-5p在NSCLC中的表達(dá)水平。本研究在前期研究[11]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了高通量數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)調(diào)研數(shù)據(jù)的更新整合,納入了全球范圍內(nèi)多中心的1 470個(gè)樣本,明確了miR-182-5p在NSCLC的2個(gè)最主要病理亞型(即LUAD和LUSC)中的表達(dá)水平比正常肺組織更高。同時(shí),RT-qPCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也證實(shí)了miR-182-5p在NSCLC中表達(dá)上調(diào)的狀況,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了miR-182-5p表達(dá)水平具有顯著區(qū)分NSCLC組織與對(duì)照肺組織的能力,提示該分子具有篩檢NSCLC患者的潛力。事實(shí)上,既往已有學(xué)者指出miR-182-5p可與數(shù)個(gè)miRNA分子聯(lián)合組成具有早期診斷NSCLC效能的標(biāo)志物[20]。本研究首次報(bào)道了單一的miR-182-5p分子具有顯著的鑒別NSCLC的潛力。這一發(fā)現(xiàn)揭示了miR-182-5p在NSCLC的潛在臨床意義,同時(shí)在一定程度上表明了本研究的新穎性。綜合前述,miR-182-5p在NSCLC中表達(dá)上調(diào),且該分子具有成為篩檢NSCLC分子標(biāo)志物的潛力。

高表達(dá)的miR-182-5p可能通過多種機(jī)制參與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展。已有多項(xiàng)報(bào)道指出高表達(dá)的miR-182-5p可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡,從而通過參與調(diào)控NSCLC細(xì)胞的生長繼而影響NSCLC的發(fā)生和進(jìn)展[21-22]。例如,Yang等[8]認(rèn)為miR-182-5p可能通過調(diào)節(jié)Caspase 2的表達(dá)來調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞的增殖和凋亡,且抑制miR-182-5p的表達(dá)可檢測到NSCLC細(xì)胞的增殖抑制和凋亡增強(qiáng)。Zhang等[23]也基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出miR-182-5p在NSCLC的促癌作用。然而,亦有學(xué)者持相反觀點(diǎn),即認(rèn)為miR-182-5p在NSCLC中發(fā)揮抑癌作用。其中,一項(xiàng)報(bào)道指出miR-182靶向NSCLC中的CTTN基因并抑制NSCLC細(xì)胞的偽足(賦予癌細(xì)胞侵襲能力)形成,從而抑制NSCLC轉(zhuǎn)移[24]。無獨(dú)有偶,Li等[19]也認(rèn)為miR-182-5p的過表達(dá)抑制了NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲,并指出這可能與該分子促進(jìn)E-鈣黏素表達(dá)有關(guān)。由此可見,miR-182-5p在NSCLC中的生物學(xué)作用及其機(jī)制十分復(fù)雜,遠(yuǎn)未完全闡明。

本研究通過計(jì)算生物學(xué)方法,聚焦于miR-182-5p在NSCLC中的潛在靶基因,探索了miR-182-5p在NSCLC中的潛在分子機(jī)制。結(jié)果提示,miR-182-5p的潛在靶基因可能與細(xì)胞內(nèi)蛋白定位的調(diào)控及細(xì)胞內(nèi)吞作用的調(diào)控等生物學(xué)進(jìn)程相關(guān),參與構(gòu)成內(nèi)吞囊泡等細(xì)胞成分以及Sh3功能結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等功能)結(jié)合等生物學(xué)功能。同時(shí),KEGG信號(hào)通路結(jié)果也提示了miR-182-5p的潛在靶基因與細(xì)胞內(nèi)吞作用信號(hào)通路相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)了miR-182-5p可能通過靶向該信號(hào)通路的EPS15(該分子已被證實(shí)參與內(nèi)吞作用[25-26])而影響細(xì)胞的內(nèi)吞作用。細(xì)胞內(nèi)吞作用通常指受體介導(dǎo)下的內(nèi)吞作用以及非受體介導(dǎo)的吞噬作用和吞飲作用,被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵途徑,多種癌癥轉(zhuǎn)移抑制分子即通過內(nèi)吞作用參與癌癥轉(zhuǎn)移的負(fù)調(diào)控[27-28]。基于此,并結(jié)合本研究結(jié)果,猜想NSCLC中的miR-182-5p高表達(dá)導(dǎo)致其潛在靶基因低表達(dá),繼而影響了細(xì)胞內(nèi)吞作用,從而利于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程,但該猜想需要將來開展實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)了miR-182-5p在NSCLC中的高表達(dá)狀態(tài),并揭示了該分子篩檢NSCLC的潛力。此外,miR-182-5p可能通過影響細(xì)胞內(nèi)吞作用而在NSCLC中發(fā)揮生物學(xué)作用,且EPS15可能是該過程中miR-182-5p的靶點(diǎn)。然而,miR-182-5p在NSCLC中的作用及分子病理機(jī)制非常復(fù)雜,仍需大量更深層次的研究。