絞股藍總苷對人腦微血管內皮氧糖剝奪的影響

解燕昭 楊梅柳 虞武 董立朋 趙景茹 陳彥霞

缺血性腦卒中致殘率高,幸存患者長期存在嚴重的身體和認知功能障礙[1]。當腦缺血后,腦組織氧化與抗氧化系統失衡,細胞內線粒體氧化磷酸化受抑制,ATP生成障礙,活性氧(reactive oxygen species,ROS)急劇增加,細胞結構造成嚴重損害,即產生氧化應激,加快細胞凋亡、壞死等。ROS誘導的氧化應激可致血腦屏障內皮細胞的緊密連接受損[2]、神經損傷加重、腦梗死體積擴大,而使用抗氧化劑治療可減輕內皮細胞損傷及血腦屏障通透性、減少神經細胞壞死[3],從而改善神經功能損傷。中醫有關中風的治療多強調活血通絡、醒神開竅等,已逐漸顯示出重要地位[4-7]。絞股藍是一種傳統中藥,絞股藍總苷具有很好的抗氧化作用[8],但筆者發現其在缺血性腦卒中的保護機制尚不明確。本研究通過氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)條件下培養人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMEC),模擬缺血性腦卒中的病理過程,并應用絞股藍總苷進行干預,旨在探討其中的抗氧化機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 HBMEC購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司,絞股藍總苷購自上海源葉生物科技有限公司,蛋白提取試劑盒購自美國Thermo;引物購自美國Promega公司。兔抗超氧化物歧化酶(SOD)單克隆抗體、兔抗編碼還原型輔酶/醌氧化還原酶[NAD(P)H:quinone oxido reductase,NQO1]單克隆抗體購自Abcam公司;β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司;0.9%氯化鈉溶液購自石家莊第四制藥廠,DMEM 培養液購自美國Sigma公司,胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;ROS試劑盒和DCFH-DA購自中國博奧森公司,熒光探針購自中國博奧森公司,CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術有限公司,PCR試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 細胞OGD模型的建立及分組 HBMEC復蘇后,使用10%FBS的DMEM培養,待細胞長至對數期時,將細胞隨機分為Control組、OGD組、OGD+GP組。Control組為對照,HBMEC應用含10%FBS的DMEM培養基常規培養24 h,OGD組為OGD組、OGD+GP組為OGD與絞股藍總苷干預組,2組均進行OGD培養24 h,條件:無糖DMEM培養液,缺氧培養箱,37℃、CO2體積分數5%、N2體積分數95%、濕度97%。其中OGD+GP組,加絞股藍總苷100 mg/L共孵育細胞。

1.3 CCK-8測定細胞活力和細胞毒性 按照說明書使用CCK-8測定HBMEC活力,將對數期生長的HBMEC接種于96孔板中,將不同濃度的絞股藍總苷:10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L放入相應的孔中。在正常氧合培養箱中培養24 h后,每孔加入10 μl CCK-8溶液測定毒性。連續OGD 10 h后,用CCK-8測定藥物療效。實驗至少重復3次。

1.4 熒光顯微鏡檢測ROS水平 DCFH-DA探針檢測HBMEC內ROS水平,培養24 h后,吸出上清液,PBS清洗3次,在24孔板中加入DCFH-DA探針(10 μmol/L),置于37℃培養箱孵育30 min,立即用熒光顯微鏡觀察ROS熒光,采集圖像。

1.5 Western Blot檢測SOD、NQO1水平 各組HBMEC用RIPA裂解,提取總蛋白,13 000 r/min、4℃ 離心15 min。取50 μg蛋白,采用SDS-PAGE電泳分離蛋白質,切膠后將蛋白轉移至PVDF膜,放入5%脫脂奶粉封閉液中,室溫封閉2 h,加入一抗,SOD(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000),室溫振搖1 h,后轉入4℃過夜。次日用TBST洗膜3次,5 min/次,加入二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,ECL顯色,將PVDF膜放置到凝膠成像分析系統中成像。

1.6 qRT-PCR檢測SOD、NQO1的mRNA水平 應用Trizol試劑,提取總RNA,按說明書步驟提取組織中總RNA后并檢測總濃度,應用逆轉錄試劑盒,按照說明書將RNA逆轉錄成cDNA(42℃,60 min,再于70℃,5 min),cDNA稀釋至50 μl,按照試劑盒說明書操作,檢測SOD、NQO1的mRNA水平,qRT-PCR檢測條件為95℃ 2 min;95℃ 15 s,60℃ 15 s,72℃ 1 min;40循環。引物如下:SOD:5’-GGGCATCATCAATTTCGA-3’/5’-AGCCTGCTGTATTATCTCCA-3’;NQO1:5’-GAAGAGCACTGATCGTACTGGC-3’/5’-GGATACTGAAAGTTCGCAGGG-3’;β-actin:5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’/GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。

2 結果

2.1 確定絞股藍總苷的有效濃度 與Control組比較,5組絞股藍總苷濃度干預后HBMEC活力無明顯差異(P>0.05),提示5種濃度絞股藍總苷對HBMEC無明顯毒性。與OGD組比較,絞股藍總苷濃度為10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的干預后HBMEC活力差異有統計學意義(P<0.05)。絞股藍總苷濃度為100 mg/L干預后細胞活力較高,因此選取絞股藍總苷濃度為100 mg/L作為有效濃度進行接下來的實驗。見表1、2。

表1 不同GP濃度干預HBMEC的細胞活力 %,

表2 不同GP濃度干預OGD后HBMEC的細胞活力 %,

2.2 絞股藍總苷減少OGD后HBMEC的ROS產生 OGD組HBMEC的熒光強度較高,提示OGD后HBMEC發生氧化應激反應,ROS水平升高,應用不同濃度絞股藍總苷后,HBMEC的熒光強度較OGD組降低,尤其應用絞股藍總苷濃度為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L組的HBMEC熒光強度明顯降低,提示絞股藍總苷可降低HBME COGD后ROS水平。見圖1。

圖1 絞股藍總苷對氧糖剝奪后HBMEC中ROS表達的影響

2.3 絞股藍總苷上調OGD后HBMEC的SOD及NQO1蛋白表達水平 與Control組比較,OGD組SOD蛋白水平有降低的趨勢,NQO1蛋白水平有上升的趨勢,與OGD組比較,OGD+GP組HBMEC的SOD、NQO1蛋白水平均上調明顯,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 絞股藍總苷對氧糖剝奪后HBMEC中SOD和NQO1蛋白圖

表3 絞股藍總苷對HBMEC中SOD和NQO1蛋白及mRNA相對表達量的影響

2.4 絞股藍總苷上調OGD后HBMEC的SOD及NQO1的mRNA表達水平 與Control組比較,OGD組SOD的mRNA水平有降低的趨勢,NQO1的mRNA水平有上升的趨勢,與OGD組比較,OGD+GP組SOD、NQO1的mRNA水平明顯上調,差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

氧化應激在缺血性腦卒中的發病過程中起到重要的作用,抗氧化治療可有效保護神經元,并減輕患者神經功能損害。現代藥理證明絞股藍主要藥效成分為絞股藍總苷,具有多種效應,如防治血脂升高[9]、血糖升高、抑制腫瘤的生長、抗御神經系統損傷、提高抵抗力、延緩衰老和固護肝臟等多種能效作用[9]。研究顯示,絞股藍總苷可降低患者體內血漿脂質過氧化物水平[10],動物實驗也證明絞股藍總苷可增強力竭運動小鼠抗氧化因子SOD的活性,達到保護組織免受自由基損傷的作用,保護心肌在缺血缺氧中的損傷[11],同時發現,絞股藍對慢性腦缺血海馬神經元具有較好的神經保護功能[12]。HBMEC是血腦屏障最重要的組成部分,在腦梗死病理生理機制中發揮重要作用,因此推測絞股藍總苷對可能通過降低HBMEC的氧化應激反應對腦組織起到保護作用。

體外培養HBMEC,通過OGD模擬腦梗死缺血缺氧微環境,發現在缺氧缺糖條件下可導致HBMEC活性下降,應用絞股藍總苷組,細胞失活狀態得到改善,本研究篩選出最佳藥物劑量為100 mg/L。研究顯示絞股藍總苷及其活性化合物在體外和體內都能預防缺氧引起的損傷,減輕血腦屏障破壞[13]。在OGD條件下,用絞股藍總苷培養HBMEC,可明顯提升細胞的活力:內皮細胞是血腦屏障最主要的構成部分,它的損傷可直接導致血腦屏障滲透性增加,根據上述推測絞股藍總苷可能在腦缺血缺氧后保護內皮細胞,從而發揮血腦屏障的保護作用。研究已表明血腦屏障的破壞與ROS引起的氧化應激密不可分[14],據此進一步檢測ROS表達情況,發現在OGD條件下HBMEC的ROS水平明顯升高,而應用絞股藍總苷后,ROS的表達降低,說明絞股藍總苷可通過降低ROS水平,減輕缺糖缺氧情況下內皮細胞的氧化應激,從而保護HBMEC。

ROS可通過緊密連接中閉合蛋白的分布和表達破壞血腦屏障的完整,還可以激活介導血腦屏障功能障礙的下游通路影響其功能[15]。血腦屏障是最重要的生理屏障,由腦微血管內皮細胞及其表面的緊密連接、周圍的星形膠質細胞、周細胞和基底膜組成。血腦屏障通過調節體循環物質的進出來維持腦微環境的穩態。血腦屏障的破壞時滲透性增加,是導致缺血性腦損傷加重的主要因素[16]。當腦組織缺血缺氧時,線粒體氧化磷酸化受抑制,細胞內ATP產生受限,能量依賴性的Ca2+泵、Na+泵不能及時將細及胞內的Ca2+及Na+運出,同時ROS水平會急劇增加,導致腦細胞凋亡、炎癥及壞死。ROS招募白細胞,刺激白細胞和內皮細胞產生粘附分子,引起細胞吞噬和免疫反應,炎性細胞積累,進一步加重腦損傷[17],這一系列的級聯損傷反應,導致神經元細胞死亡、神經炎癥和血管破壞,進而加重腦功能障礙[18]。本研究結果提示絞股藍總苷可通過降低ROS水平減輕HBMEC損傷,因此絞股藍總苷有可能減輕血腦屏障的破壞,從而發揮神經保護作用。

氧化應激發生時,細胞內的抗氧化系統也發生改變。研究顯示,心肌缺血再灌注損傷時,使用絞股藍總苷預處理可保護心肌細胞活力,減少氧化應激反應,保護心肌細胞;絞股藍總苷也可通過ROS表達減少,SOD表達增加降低氧化應激水平[19,20]。因此我們推測絞股藍總苷可能提高細胞內抗氧化因素,短暫性腦缺血發作患者應用神經保護劑后可提高SOD活力,通過減少脂質過氧化物及減輕自由基介導的毒性,增加抗氧化能力,進而改善腦缺血損傷后神經功能缺損評分,促進損傷后神經功能恢復[21]。NQO1是還原型谷胱甘肽的合成限速酶,對抗氧化應激能力的提高有重要作用[22],腦缺血后,NQO1表達明顯上升,減少ROS的形成,使細胞內氧化還原反應趨于平衡,減輕神經細胞的氧化應激損傷。進一步檢測HBMEC在不同條件下SOD及NQO1蛋白的情況,結果顯示在OGD時應用絞股藍總苷,可提高內皮細胞的抗氧化因子SOD及NQO1蛋白及mRNA的表達,這說明能量缺乏時,絞股藍總苷可在轉錄水平提高內皮細胞的抗氧化能力。同樣也有研究顯示與野生型動物相比,缺乏SOD的小鼠極易發生短暫性局灶性腦缺血,且血管源性水腫更嚴重,死亡率更高,SOD表達升高后可減輕腦缺血后血腦屏障損傷[23]。NQO1是人體Ⅱ相抗氧化酶和重要的抗氧化物質,可催化ROS的還原反應[24],既往研究表明在缺血缺氧缺乏條件下內皮細胞內NQO1升高,起到腦保護作用,結合我們研究結果表明應用絞股藍總苷后上調NQO1表達,從而發揮保護作用。

綜上所述,絞股藍總苷可在OGD后通過降低ROS及上調抗氧化因子SOD及NQO1的表達,調節HBMEC內氧化應激水平,保護內皮細胞。