基于Nrf2/BNIP3通路探討苓桂術甘湯改善心肌梗死誘導大鼠心力衰竭的作用及機制

王 翔,莫佳佳,湯同娟,周 鵬,黃金玲

(1. 安徽中醫藥大學護理學院,安徽 合肥 230012;2.合肥醫工醫藥股份有限公司,安徽 合肥 230601;3.安徽省藥物再創新工程技術研究中心,安徽 合肥 230601;4. 安徽中醫藥大學中西醫結合學院,安徽 合肥 230012)

急性心肌梗死簡稱心梗,被認為是心力衰竭發生最常見及最重要的起始因素之一[1],而心室重構是心梗后引發心衰的基本病理基礎,并貫穿心衰的始終[2]。因此,減緩或逆轉心梗后心室重構是治療心衰的關鍵。研究發現[3]氧化應激參與了心室重構的病理生理過程,是心室重構的重要啟動機制之一。通過調控氧化應激途徑進行有效的抗氧化治療可改善梗死后心室重構,阻抑心衰的發展[4]。課題組前期研究表明中藥復方苓桂術甘湯可有效延緩心室重構、改善心衰模型大鼠心功能[5-6]。近期研究發現,該方可以通過調節Nrf2/BNIP3 通路減輕心肌細胞氧化應激損傷,發揮心肌保護作用[7]。基于此,本研究旨在探討苓桂術甘湯抑制心室重構防治心衰的作用機制是否與調節Nrf2/BNIP3信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 動物60只SD大鼠(♂、體質量180～220 g)購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物許可證號為SCXK(魯)2019-003,飼養環境:溫度(20～24 ℃),濕度(40%～60%)。

1.2 藥物苓桂術甘湯由茯苓(2005181)12 g、桂枝(2005181)9 g、白術(2002202)9 g、甘草(1911 041)6 g組成,藥物飲片均購于安徽普仁中藥飲片有限公司。參照課題組前期的提取方法[8]將苓桂術甘湯制備成含4.8 g生藥/g的干浸膏,分裝密封后保存于4 ℃冰箱。卡托普利片(1012016080156)購于中孚藥業股份有限公司。

1.3 試劑與儀器ROS、SOD檢測試劑盒(CA1410、BC0175)、天狼星紅染色液試劑盒(G1470)購自北京Solarbio;NT-proBNP、BNP檢測試劑盒(RX302959R、RX302462R)購自泉州睿信生物科技有限公司;CytC抗體(11940)購自美國CST 公司;Nrf2抗體(ab137550)、 BNIP3抗體(ab109362)、VDAC抗體(ab154856)、LaminA抗體(ab8980)、GAPDH抗體(ab181602)購自美國Abcam公司。 ACUSON OXANA彩色多普勒超聲診斷儀(德國西門子公司),ECG-2303B數字心電圖機(廣州市三銳電子科技有限公司),ATOM全自動酶聯免疫工作站(意大利MAROCHE),Tanon6600發光成像工作站(上海Tanon),H-7500型透射電鏡(日本HITACHI)。

1.4 動物分組與給藥動物適應性飼養一周后,剔除不合格動物后參考文獻[9]并結合課題組前期經驗,選用6-0眼科縫合線結扎冠狀動脈左前降支制備心梗模型。假手術(Sham)組大鼠采用同樣的手術方式,但僅穿線不打結。每只大鼠予8萬U/d的青霉素溶液腹腔給藥,連續3 d,預防感染。結扎14 d后,將存活的模型大鼠隨機分成3組:模型(Model)組、苓桂術甘湯(LGZGD)組(劑量為4.2 g·kg-1)[6,10]和卡托普利(Captopril)組(劑量為0.002 57 g·kg-1),每組各10只。LGZGD組、Captopril組采用灌胃給藥,容積為10 mL·kg-1,Model組和Sham組灌以等容積的蒸餾水,每天1次,連續28 d。

1.5 標本制備與采集行超聲檢測后,于腹主動脈處采取血液樣本,分離血清,分裝標記好后放入-80 ℃的冰箱中保存備用。腹主動脈取血后,快速取出心臟,用冰的PBS溶液反復沖洗后剪去心耳、脂肪等附屬物,并用濾紙將液體吸干。在心臟結扎點之下進行橫切,一部分組織固定于4%多聚甲醛中用做天狼星紅染色及免疫熒光檢測,一部分固定在2.5%戊二醛中用做透射電鏡分析,一部分組織剪成小塊后立即液氮速凍并放入-80 ℃的冰箱中凍存用做Western blot檢測。

1.6 觀察指標與檢測方法

1.6.1超聲心動圖檢測大鼠心臟功能 于末次灌藥后24 h,1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注入對大鼠進行麻醉,固定備皮后在二維超聲引導下,通過M超在左室長軸切面水平測量左室收縮末內徑(left ventricular internal dimension systole,LVIDs)、左室舒張末期內徑(left ventricular internal dimension diastole,LVIDd)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)以及左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.6.2ELISA法檢測血清BNP、NT-proBNP濃度 根據試劑盒說明采用ELISA法檢測大鼠血清中BNP、NT-proBNP的濃度。

1.6.3天狼星紅染色檢測心肌組織膠原纖維變化 將固定好的心臟組織切片,厚度6 μm,常規脫蠟水化;weigert鐵蘇木素染色液染色10 min;水洗5 min,蒸餾水洗一次;天狼星紅染色液滴染1 h;切片用水沖洗,脫水,清除,用中性樹膠密封;隨機選取一個視野運用顯微鏡(×400)拍照。

1.6.4免疫熒光法檢測心肌組織ROS、微量法檢測心肌組織SOD 稱取新鮮心肌組織,勻漿,低溫離心,取上清。ROS檢測:在96孔板中加入上清液與探針,混勻避光孵育后采用熒光分光光度計檢測熒光強度。SOD按照試劑盒說明書檢測。

1.6.5透射電鏡檢測心肌組織線粒體超微結構 心肌組織用PBS沖洗干凈后,修剪成1 mm×1 mm×2 mm長條狀,2.5%濃度的戊二醛磷酸緩沖液固定2 h。然后在0.1 mol·L-1磷酸中漂洗和洗滌3次,1%鋨酸固定液固定3 h,而后用0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗3次;脫水浸透包埋后,取出包埋樣品,用切片機將該組織切片切成超薄切片(50～70 nm);用乙酸雙氧鈾+檸檬酸鉛雙重電子染色后用透射電鏡進行觀察。

1.6.6Western blot法檢測CytC、Nrf2蛋白表達 提取心肌組織蛋白、線粒體蛋白、細胞漿蛋白、細胞核蛋白,凝膠電泳后轉膜,加入合適濃度的一抗(CytC 1 ∶1 000、Nrf2 1 ∶1 000)孵育過夜,加入一定濃度的二抗,洗膜,將膜蛋白面與化學發光劑充分接觸5 min,然后用Tanon 6600發光成像工作站進行檢測并使用Image Pro Plus 6.0軟件分析蛋白相對表達量。

1.6.7免疫熒光法檢測心肌組織Nrf2、BNIP3的表達 制作石蠟切片,脫蠟修復,滴入濃度為5%的BSA封閉,滴加一抗(Nrf2 1 ∶200,BNIP3 1 ∶150),4 ℃孵育過夜;PBS清洗。切片甩干后,滴加二抗,室溫下孵育60 min,并避光;PBS清洗,滴加DAPI染液,室溫下避光孵育5 min;PBS清洗,滴加適量防熒光淬滅劑,樹脂封片劑封片,使用熒光顯微鏡在630×倍視野下隨機選擇視野進行拍照。

2 結果

2.1 各組大鼠死亡率及行為體征變化情況在藥物干預的28 d內,Model組大鼠有2只死亡,其余各組均無死亡。此外,實驗過程中Sham組大鼠進食進水量正常,活動狀態良好,毛發有光澤,沒有稀便;Model組大鼠進食飲水量減少,活動性下降,喜聚堆,毛發不榮偏于萎黃,部分大鼠大便不成形,肛門周圍有污物;而LGZGD組及Captopril組活動狀態較Model組好,且LGZGD組大鼠,覓食積極性增加,毛發較為光滑,鮮出現稀便。

Fig 1 Ultrasound images of rats and analysis of ultrasonic index of rats in each

2.2 苓桂術甘湯對心梗后心衰大鼠心功能的影響如Fig 1所示,與Sham組大鼠比較,Model組大鼠的LVEF與LVFS均明顯降低(P<0.01),表明心肌梗死后大鼠的心功能嚴重受損;LVIDd和LVIDs均明顯增加(P<0.01),表明心梗后心衰大鼠的左室出現了較為嚴重的擴張,心室重構明顯;而用LGZGD或Captopril治療后LVEF和LVFS均有明顯的升高(P<0.01),且左室擴張導致的心室內徑的增大也得到了明顯的改善(P<0.01),表明苓桂術甘湯可改善心梗后心衰大鼠的心功能。

2.3 苓桂術甘湯對心梗后心衰大鼠血清BNP、NT-proBNP的影響BNP、NT-proBNP被指南推薦為心梗后心衰的診斷、病情嚴重程度及預后的重要評價指標。如Fig 2所示,Model組BNP、NT-proBNP較Sham組明顯升高(P<0.01),表明心肌梗死導致心衰的過程可使大量BNP、NT-proBNP合成并釋放入血,而用LGZGD或Captopril治療后可使上述指標得到明顯改善(P<0.01),表明苓桂術甘湯可以防治心衰的發展。

2.4 苓桂術甘湯對心梗后心衰大鼠心肌組織膠原纖維變化的影響細胞外基質成分的改變是除細胞結構和功能的改變之外心室重構的另一重要病理改變。如Fig 3所示,Sham組大鼠心肌組織可見少量紅染絲狀纖維,但沒有明顯的紅色膠原沉積,且肌絲排列有序且緊密;Model組大鼠心肌組織可看到膠原呈束狀浸潤性分布,且有大量的紅色膠原纖維沉積,肌絲排列紊亂;LGZGD或Captopril的治療改善了上述病理改變,紅色膠原物質在兩組的心肌細胞中明顯減少,極大改善了膠原沉積。表明苓桂術甘湯可以減輕心肌間質膠原的過度沉積。

Fig 2 Changes of serum BNP and NT-ProBNP in rats of each

Fig 3 Sirius staining results of myocardial tissue of rats in each group(×400)

2.5 苓桂術甘湯對心梗后心衰大鼠心肌組織ROS、SOD的影響如Fig 4所示:與Sham組相對比,Model組大鼠心肌組織中的ROS水平升高(P<0.01),且伴隨著SOD活性明顯下降(P<0.01);而經LGZGD或Captopril治療后,與Model組相比較,ROS水平明顯降低(P<0.01),而SOD活性明顯提升(P<0.01),上述結果表明苓桂術甘湯具有減輕心梗后心衰大鼠氧化應激的作用。

Fig 4 Detection results of oxidative stress indicators |ROS, SOD in rat myocardial )

2.6 苓桂術甘湯對心梗后心衰大鼠線粒體損傷的影響如Fig 5 所示,Sham組線粒體排列有序,形態與數量均正常,線粒體嵴結構清晰、排列整齊;在Model組大鼠心肌組織的線粒體上可觀察到一部分發生固縮變小,一部分發生腫脹或者外膜破損或呈明顯空泡化,部分線粒體出現嵴斷裂;LGZGD或Captopril治療后,大鼠心肌組織線粒體腫脹程度與空泡化明顯減輕,嵴大致趨于正常。上述結果表明苓桂術甘湯可有效抑制氧化應激所致的線粒體損傷。

Fig 5 Observation of structure changes of mitochondria in myocardial tissue of rats in each group under electron microscope (×10k)

2.7 苓桂術甘湯對心梗后心衰大鼠心肌組織線粒體CytC、細胞質CytC的影響CytC的釋放是細胞線粒體途徑凋亡的標志。如Fig 6所示,相對于Sham組,Model組大鼠線粒體CytC降低、細胞質CytC含量升高,差異均具有統計學意義(P<0.01),表明心梗后心衰大鼠心肌細胞線粒體中的CytC釋放到細胞質;而經LGZGD或Captopril治療后,與Model組相比,線粒體CytC含量明顯升高(P<0.05),而細胞質CytC含量明顯降低(P<0.05),上述結果表明苓桂術甘湯可減少線粒體CytC的釋放,抑制線粒體凋亡途徑。

2.8 苓桂術甘湯對心肌組織Nrf2、BNIP3表達的影響如Fig 7、8所示,與Sham組相比,Model組Nrf2表達量上升(P<0.01),且有少量Nrf2入核(P<0.05);與Model組相比,LGZGD或Captopril組Nrf2表達量明顯上升(P<0.01),且Nrf2大量入核(P<0.01)。如Fig 9所示,Sham組中的BNIP3熒光強度較低,表達量較少;與Sham組相比,Model組綠色熒光強度增強,BNIP3表達量明顯上升(P<0.01);與Model組相比,LGZGD和Captopril熒光強度降低,BNIP3表達量明顯下降(P<0.01)。提示苓桂術甘湯可以促進Nrf2的表達及核移位,降低BNIP3的表達。

Fig 6 Mitochondrial CytC and cytoplasmic CytC test results of myocardial cell apoptosis indexes in each )

Fig 7 Immunofluorescence staining of Nrf2 in myocardial tissue ,n=3)

Fig 8 Mitochondrial Nrf2 and cytoplasmic Nrf2 test results of myocardial cell apoptosis indexes in each

3 討論

AMI后心室重構為AMI后心室在大小、形態、結構與功能上發生改變的過程。研究表明[3]心梗后的心室重構涉及氧化應激的產生,而由氧化應激引起的細胞凋亡效應參與心室重構的全過程。心肌細胞的凋亡主要通過線粒體途徑與死亡途徑產生,其中線粒體途徑在細胞凋亡中發揮著不可或缺的作用,當線粒體受氧化應激誘導時,ROS可介導線粒體損傷,線粒體結構與功能會發生亞水平上的重構,激活凋亡細胞激酶,并將凋亡基因調節蛋白如CytC等釋放入細胞質,進一步誘導細胞的凋亡,使心肌組織功能受損加劇,心臟重構加重,最終導致心衰。

Nrf2是一種氧化應激敏感的轉錄因子,已被證明受ROS水平的影響,一旦被激活,它可以由細胞質轉移進入細胞核內,通過影響ROS的合成、控制內源性抗氧化劑產生來維持細胞氧化還原穩態,有效抵御細胞的損傷與凋亡。研究發現Nrf2在心血管疾病的防治中發揮著重要的調控作用[11]。敲除Nrf2基因的小鼠會出現左心室舒張功能障礙,并迅速從心臟代償適應過渡到心衰,而過表達的Nrf2可有效保護受H2O2誘導的心肌損傷后心肌細胞線粒體的形態和功能[12-13]。受Nrf2調控的BNIP3是最新發現的氧化應激線粒體傳感器[14],ROS的增加可誘導其激活,激活后的BNIP3可進入線粒體外膜,引起線粒體的腫脹,促進CytC的釋放進而介導線粒體功能障礙,導致細胞凋亡或死亡[15]。同時被激活的BNIP3基因亦可促進ROS的產生,加重線粒體功能的失調[16]。研究表明[17]BNIP3參與誘導心梗后的心室重構過程,下調BNIP3可減少體內細胞凋亡,抑制心肌梗死后誘發的心室重構,有效防治小鼠心衰的發展。

Fig 9 Immunofluorescence staining of

研究發現[18]冠脈成功結扎后的2～6周即可形成心衰。因此本實驗在前期研究的基礎上,于結扎后的第14 天開始給藥,連續給藥28 d。超聲結果表明模型大鼠出現了左心室的擴張,心室順應性的降低(LVIDs、LVIDd升高),左室泵血功能降低(LVEF、LVFS下降),結合模型大鼠血清中心衰標志物BNP、NT-proBNP的明顯升高,以及心肌細胞出現壞死及嚴重的纖維化,表明大鼠的心臟功能嚴重受損,提示心梗后心衰模型建立成功。Captopril為血管緊張素轉化酶抑制劑,是臨床上治療心力衰竭的基礎用藥之一,本研究選擇captopril作為陽性對照藥物,在研究中發現captopril及LGZGD均能有效降低心衰大鼠的死亡率,但相對于captopril,LGZGD可明顯改善模型大鼠的毛發光澤度、提高食欲、減少其稀便癥狀,在提高心衰大鼠的生存質量上具有獨特優勢。另本研究發現在模型動物心肌組織中可檢測到ROS的升高與SOD的降低,表明氧化應激參與了心梗后心衰的過程,且透射電鏡結果顯示心梗后心衰模型大鼠出現線粒體結構的損傷。線粒體受氧化應激損傷后,引起模型動物線粒體CytC的大量釋放,導致了心臟功能的障礙。此外,免疫熒光及Western blot結果顯示模型動物Nrf2 蛋白核轉運應激性增加,BNIP3蛋白表達明顯增加,這些變化提示氧化應激引起了Nrf2 的解離,促進BNIP3的高表達,從而啟動了線粒體凋亡途徑。而LGZGD的干預可以減輕心梗后心衰模型大鼠的氧化應激水平,保護線粒體結構,減少心肌細胞的凋亡,且可促進Nrf2的核移位,降低BNIP3的表達,從而發揮治療心衰的作用。值得注意的是,在本研究中LGZGD干預后隨著心肌組織細胞Nrf2的核移位的明顯增加,胞質中Nrf2蛋白表達卻無明顯降低,這可能與LGZGD干擾了Keap1-Nrf2結合,使Nrf2從泛素化系統中釋放,從而減少Nrf2的降解,補償細胞質的Nrf2有關[19-20]。

綜上,本研究以影響心衰進程中心室重構的主要影響因素—氧化應激為主要切入點,提出并證實了Nrf2/BNIP3通路參與心梗后心衰病理生理過程的重要分子機制,為心衰的防治提供了潛在的有效治療靶點。通過實驗發現,苓桂術甘湯對心梗后心衰大鼠外在表征、心臟功能、組織病理學、線粒體功能、蛋白表達等各個層面均有較好的改善與調節作用,充分反映了中藥復方多層面、多環節、多靶點的綜合治療作用,為經方防治心衰的臨床應用提供了一定的理論與實驗依據。