肌球蛋白磷酸化靶向亞基家族與心血管疾病

趙文巧 朱柏俊 劉宇峰 曹明欣 鄧凱 吳心欣 吳華英

(湖南師范大學醫學院,湖南 長沙 410013)

心血管疾病是全世界成人死亡的主要原因[1]。血管平滑肌功能失調是多種心血管疾病發生發展的共同特點。肌球蛋白磷酸化靶向亞基(myosin phosphatase targeting subunit,MYPT)作為肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)的靶向亞基,可通過磷酸化調控MLCP活性而影響肌球蛋白調節輕鏈(myosin regulatory light chain,MLC)的磷酸化,影響細胞功能,參與對血管平滑肌收縮與舒張過程的調節[2]。已有研究表明MYPT家族參與多種心血管疾病的發生發展,如心臟肥大、心力衰竭、原發性高血壓、冠心病、腦卒中等。了解MYPT家族在心血管疾病中的研究現狀,有助于闡明疾病的發生機制,并為其治療提供新思路。

1 MYPT家族成員結構

MYPT家族包括5個成員,分別是MYPT1(PPP1R12A)、MYPT2(PPP1R12B)、MYPT3(PPP1R16A)、MBS85(PPP1R12C)、TIMAP(PPP1R16B)。有研究[3-4]比較了MYPT家族5個成員的序列,發現MYPT家族成員共享幾個保守結構域,包括位于N端附近用于與蛋白磷酸酶1催化亞基(protein phosphatase 1 catalytic subunit,PP1c)結合的RVxF基序,以及緊隨其后的幾個錨蛋白重復序列。錨蛋白重復序列形成了一個與多種蛋白質結合的交互平臺,包括底物磷酸化肌球蛋白。此外,還發現MYPT1、MYPT2和MBS85含有C-末端亮氨酸拉鏈(leucine zipper,LZ)結構域,LZ結構域在NO/cGMP/PKG通路對MLCP活性的調控中發揮重要作用[5]。MYPT3和TIMAP缺乏LZ結構域,但它們含有1個C-末端CAAX盒,可將蛋白靶向到質膜上[3]。MYPT家族成員受各種蛋白激酶在多個位點的磷酸化調節。研究發現Rho相關激酶(Rho-related kinase,ROCK)通過催化Thr696和Thr853位點的磷酸化來調節MYPT1[6],這兩個位點在MYPT2中是保守的,而在MBS85中只有Thr696對應的位點保守,在TIMAP和MYPT3中則沒有發現這兩個位點[3]。

盡管MYPT家族成員之間有很多相似性,但它們的組織分布卻有著一定的差異。MYPT1主要在平滑肌中表達,而MYPT2主要在腦和橫紋肌中表達。MBS85是一種普遍表達的蛋白,它是強直性肌營養不良相關Cdc42結合激酶-α的底物,介導了由Cdc42誘導的肌動蛋白重組[7]。MYPT3在心臟、大腦和腎等多個器官中表達,與其他成員不同的是,MYPT3與PP1c結合會抑制后者對MLC的催化活性[8]。TIMAP是MYPT家族的內皮特異性成員,主要定位于內皮細胞的質膜上,并通過與非整合蛋白層粘連蛋白受體1和埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin proteins,ERM蛋白)等的相互作用發揮廣泛的生理功能[9]。

2 MYPT家族成員與細胞功能

2.1 細胞收縮

細胞收縮裝置主要由肌動蛋白和肌球蛋白組成,此裝置既依賴于Ca2+又依賴于磷酸化,基礎Ca2+水平或MLC磷酸化狀態的恢復會使收縮的肌肉恢復到非收縮狀態。平滑肌收縮取決于細胞質內Ca2+濃度的增加,Ca2+可與鈣調蛋白結合,進而激活鈣調蛋白依賴性肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK),使其磷酸化MLC的Ser19或Thr18,磷酸化的MLC與肌動蛋白相互作用,從而導致平滑肌收縮[10]。橫紋肌收縮也涉及此機制,但不是其主導機制[10]。

MLC去磷酸化由MLCP介導。MLCP是一個異源三聚體,由PP1c、MYPT和M20組成[11]。PP1c是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶,是MLCP發揮作用的核心酶。MYPT通過RVxF基序與PP1c結合,并將其特異性導向MLC,從而賦予MLCP特異性[2]。MYPT的磷酸化會影響PP1c與MLC結合,從而調節MLC磷酸化水平,改變平滑肌舒縮狀態。

2.2 細胞運動

細胞運動中最關鍵且必需的事件之一是MLC的循環磷酸化和激活[12]。MLCK或ROCK催化MLC磷酸化,從而激活肌球蛋白,使肌球蛋白能結合肌動蛋白并利用ATP產生運動。相反,MLCP對MLC的去磷酸化則降低了肌球蛋白對肌動蛋白的親和力。MYPT通過調節MLCP活性影響MLC的磷酸化,從而參與調控細胞運動過程。

2.3 胞質分裂

收縮環是胞質分裂的重要結構,主要由肌動蛋白和肌球蛋白Ⅱ裝配而成。有研究[13]通過比較過表達不可磷酸化的MLC(T18A/S19A)細胞和野生型MLC細胞,發現前者收縮環排列受阻,胞質分裂不完全,而野生型MLC細胞收縮環排列和胞質分裂均正常。這揭示MLC Thr18/Ser19的磷酸化對收縮環的正常排列是重要的。MYPT對MLCP活性的調節可影響MLC磷酸化,從而參與調控胞質分裂過程。

2.4 細胞骨架

細胞骨架參與細胞分裂和收縮等多種細胞功能。有研究[14]通過測定一個網柄菌肌球蛋白缺陷突變體的細胞骨架組織和生理反應,發現其微管網絡形態和分布異常,且細胞分裂等功能也存在異常。由此推測肌球蛋白可能與細胞骨架存在某種聯系。隨后有研究[15]發現肌球蛋白Ⅱ參與細胞骨架的組裝,并在細胞骨架中與F-肌動蛋白緊密結合,并通過MLC Thr18/Ser19的磷酸化來調節其功能。MYPT可影響MLC的磷酸化,從而參與調控細胞骨架的組裝和功能。

ERM蛋白為跨膜蛋白和底層細胞骨架之間的接頭,特殊位點的磷酸化可使其活化而發揮功能[16]。研究[17]發現MLCP可通過介導ERM蛋白的去磷酸化在細胞骨架中發揮調節作用。此外,MYPT與微管相關蛋白Tau和微管相關蛋白2存在相互作用關系,提示MYPT可能調節微管動力學[18]。

2.5 細胞黏附

研究[19]發現,p-MYPT/MYPT比值的增加會促進單核細胞-內皮細胞黏附,這表明MYPT可通過磷酸化調控單核細胞-內皮細胞黏附。此外,肌動蛋白細胞骨架可調節鈣黏蛋白之間的相互作用,后者在調節細胞-細胞黏附中發揮重要作用[20]。肌球蛋白對肌動蛋白細胞骨架至關重要,MYPT通過調節MLC的磷酸化而影響其功能,從而影響肌動蛋白細胞骨架的正常形成及功能,并借此調節鈣黏蛋白的相互作用而影響細胞-細胞黏附。

3 MYPT家族成員與信號通路

3.1 Rho/ROCK信號通路

Rho家族是鳥嘌呤核苷酸結合蛋白RAS超家族的組成部分,RhoA是該家族中研究最多的一個。RhoA及其下游靶標ROCK在細胞收縮、遷移等廣泛的生理過程和Rho/ROCK信號通路中發揮重要作用[21]。ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,有兩種亞型,ROCK1和ROCK2[22]。它們在體內普遍表達,ROCK1在肝、脾、腎等非神經性組織中表達水平較高,而ROCK2主要在腦、肌肉和心臟中表達[23]。RhoA/ROCK通路的上游信號之一是血管緊張素Ⅱ或其他多肽,如內皮素-1、成纖維細胞生長因子和轉化生長因子-β與細胞膜上的受體結合[24],然后通過其受體G偶聯蛋白來動員Gq蛋白的G-α亞單位(Gαq),從而激活Rho-鳥嘌呤交換因子,以鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)取代鳥苷二磷酸[25]。隨后GTP-Rho通過與ROCK結構中的Rho結合結構域相互作用使ROCK激活[26]。

ROCK可磷酸化MYPT1,抑制MLCP的活性,使MLC持續磷酸化,從而參與調控肌球蛋白基礎上的細胞收縮、黏附等一系列細胞功能[27]。研究發現Rho/ROCK通路在許多病理生理過程中發揮重要作用,如心力衰竭[28]和動脈粥樣硬化[29]等。

3.2 NO/cGMP/PKG通路

一氧化氮(nitric oxide,NO)是重要的血管內皮舒張因子,其舒張血管作用主要是通過增加環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)的產生,進而激活cGMP依賴性蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)而實現。PKG如何實現對血管的調控?研究[30]發現,PKG通過與MYPT1結合介導MLCP活化,從而導致Ca2+脫敏和血管舒張。MYPT1亞基可通過3’端31bp外顯子的選擇性剪接,生成不同的C-末端LZ陽性(LZ+)或LZ陰性(LZ-)結構域[31]。NO/cGMP/PKG通路誘導的血管舒張與MYPT-LZ+/LZ-有關。當缺乏LZ結構域時,PKG可與MYPT1-LZ-結合,但磷酸化和Ca2+脫敏不會發生。當LZ表達時,NO下游的cGMP、PKG和MLCP活性增加[5]。這種效應需要PKG1α磷酸化MYPT1[30]。PKG1α在MYPT1上的磷酸化位點主要是Ser695,此位點的磷酸化會干擾相鄰Thr696的磷酸化,從而消除磷酸化Thr696對MLCP的抑制,重新激活MLCP并導致Ca2+脫敏,進而誘導平滑肌松弛[32](見圖1)。

注:AngⅡ,血管緊張素Ⅱ;ET-1,內皮素-1;FGF,成纖維細胞生長因子;TGF-β,轉化生長因子-β;RhoGEF,Rho-鳥嘌呤交換因子;GDP,鳥苷二磷酸;sGC,可溶性鳥苷酸環化酶;PKG,蛋白激酶G。

4 MYPT家族成員與心血管疾病

4.1 心臟肥大

心臟肥大多由主動脈狹窄和高血壓等應激引起,最初是一種保護性的代償機制,但持續和過度應激誘導的病理性心臟肥大是不利的,并最終可能導致心力衰竭等嚴重后果。

研究[33]表明MLC磷酸化可抑制心臟肥大。MLCK家族由MLCK-1、MLCK-2、MLCK-3和MLCK-4組成[34]。心肌MLC的磷酸化主要由MLCK-3即cMLCK調控,cMLCK在心房和心室中高度且等水平表達,且對培養物中分離的心肌細胞發揮正性肌力作用[35]。此外,MLCK-4也在心肌中表達[36]。故心肌MLC磷酸化可由兩種蛋白激酶來調節。

在心臟中,MYPT1和MYPT2都表達,但MYPT2比MYPT1表達更豐富[37]。MYPT2可調節MLCP活性,影響MLC的去磷酸化,從而調控心肌MLC的磷酸化水平,影響心臟肥大的發生發展。

4.2 心力衰竭

心力衰竭是由心排血量減少不能滿足機體需要而導致的一種臨床綜合征。研究[38]表明心肌MLC磷酸化的變化在心力衰竭進展過程中發揮重要作用。MYPT2作為心臟MLCP的靶向亞基,可影響心肌MLC去磷酸化從而參與對心力衰竭的調控。

充血性心力衰竭是心力衰竭的一種常見類型,其特征是血管收縮異常和對NO介導的血管舒張效應受損[39]。MYPT1-LZ+亞型是NO發揮血管舒張效應的重要結構[3]。研究[39]表明,心力衰竭患者對NO介導的血管舒張敏感性降低可部分歸因于MYPT1-LZ+亞型表達水平的降低。故臨床上可使用調節MYPT-LZ+亞型表達的藥物,如血管緊張素轉化酶抑制劑在治療心力衰竭上效果較好[3]。

4.3 高血壓

高血壓是最常見的心血管疾病,也是導致腦卒中、冠心病等疾病的重要危險因素。高血壓的一個重要特征是血管阻力增加,血管收縮增強。MYPT可影響MLC的磷酸化水平,從而調控血管舒縮。

平滑肌的主要MYPT亞型是MYPT1。ROCK可磷酸化MYPT1的Thr696、Thr853位點而抑制MLCP活性,使MLC磷酸化水平增高。此外,ROCK還可使蛋白激酶C磷酸酶抑制蛋白17 (C-kinase-potentiated protein phosphatase 1 inhibitor of 17 kDa,CPI-17)磷酸化[40],磷酸化的CPI-17通過與PP1c結合來抑制MLCP活性[41]。使用Y27632(ROCK抑制劑)阻斷ROCK活性對多種實驗性高血壓大鼠均具有降血壓作用[42]。阻斷ROCK活性可能成為高血壓治療的重要靶點。

4.4 冠心病

冠狀動脈痙攣在多種缺血性心臟病的發病機制中起著重要作用,而痙攣的中心機制是血管平滑肌的過度收縮[43]。MYPT1可通過影響MLC磷酸化而參與調節血管平滑肌舒縮狀態,在冠狀動脈痙攣中發揮重要作用。

急性冠脈綜合征是冠心病的一種嚴重類型,多由動脈粥樣硬化斑塊破裂伴血栓形成引起。研究[44]表明,血小板活化并形成血栓是急性冠脈綜合征發病的一個重要機制。血小板形態變化是血小板活化的早期事件,MLC磷酸化以及與細胞骨架結合是觸發血小板形態變化的主要原因[45]。血小板中的MYPT亞型主要是MYPT1。MYPT1可影響MLC的磷酸化,調控血小板活化。

Rho/ROCK通路在血小板活化過程中發揮重要作用[46],此外,還參與內皮功能障礙的調節、炎癥等,在動脈粥樣硬化的發生發展中發揮重要作用[29]。另有研究[47]發現,ROCK的抑制顯著限制了喂食無膽酸鹽高脂肪飲食的低密度脂蛋白受體敲除小鼠的早期動脈粥樣硬化斑塊的發展。這表明抑制ROCK是治療動脈粥樣硬化的潛在靶點。

4.5 腦卒中

缺血性腦卒中由大腦缺血缺氧而引起。小膠質細胞和T細胞等炎癥細胞介導的神經炎癥在缺血性腦卒中的發病機制中起重要作用[48]。研究發現,ROCK抑制劑Fasudil可抑制小膠質細胞分泌促炎因子[49],且ROCK在T細胞的活化及跨內皮遷移等過程中發揮重要作用[50]。此外,血小板ROCK2對血栓形成和穩定至關重要,是血栓栓塞性腦卒中的重要致病介質[51]。MYPT作為Rho/ROCK通路的主要下游靶標,參與T細胞跨內皮遷移[50]、血小板活化等多個過程的調控,在腦卒中的發病過程中發揮重要作用。

5 結語

MYPT家族成員在結構上存在相似性,但在組織分布上具有差異,MYPT對MLC磷酸化在參與細胞收縮、細胞運動、細胞黏附等生物學過程中發揮重要作用,參與Rho/ROCK通路與NO/cGMP/PKG通路的調控。MYPT1作為ROCK的主要下游靶標,是目前MYPT家族研究最為廣泛的,參與許多心血管疾病如心臟肥大、心力衰竭及高血壓等的發生發展,家族其他成員如TIMAP與心血管疾病的聯系也有報道,但家族成員之間是否存在相互作用影響疾病的發生發展值得探討。總之,MYPT家族在心血管疾病中的功能表現,有望成為疾病防治的潛在靶標。