血管緊張素Ⅱ通過抑制人心房成纖維細胞BKCa通道誘導心房纖維化

賈春森 李磊 李勁平 譚宏偉 周偉 聶永梅 于風旭

(西南醫科大學附屬醫院心臟大血管外科,四川 瀘州 646000)

心房顫動(房顫)是臨床上最為常見的心律失常,有較高的發病率與死亡率,其發病機制復雜,其中以心房纖維化為代表的結構重構是重要始動因素[1]。既往研究證實,血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)可能是促進心房纖維化的重要因子,其作為心臟局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統[2]中最具生物活性的因子之一[3],可刺激人心房成纖維細胞分泌轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),引起膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ)和膠原蛋白Ⅲ (collagen Ⅲ)等膠原合成增加,并降低膠原酶活性,促進膠原沉積[4-5],從而導致膠原聚集而引起心房纖維化。

此外,研究表明AngⅡ能在腸系膜動脈平滑肌細胞中調節大電導鈣激活鉀通道(large conductance calcium-activated potassium channel,BKCa通道)的活性[6],該通道是廣泛存在于多種細胞的細胞器中的一種離子通道,受到胞內 Ca2+與電壓的共同調節,在去極化時電導可達到200 pS左右[7-9]。該通道由α亞基與β亞基結合后形成,其中α亞基是功能性單位,對β亞基起調節作用。大量研究表明,BKCa通道與高血壓[6]、糖尿病腎病[10]、急性心肌梗死[11]、房顫[12]等疾病的發生發展相關。然而,在心房纖維化中,Ang Ⅱ是否通過調控BKCa通道的表達參與其進程尚不清楚。因此,本研究將Ang Ⅱ、BKCa通道以及心房纖維化三者結合起來,探討BKCa通道在Ang Ⅱ誘導的心房纖維化中的作用,為理解心房纖維化的機制提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

主要實驗試劑包括:AngⅡ(Sigma,美國)、蛋白裂解緩沖液(碧云天,中國)、主要抗體(Abcam公司,美國)、蛋白裂解緩沖液(碧云天,中國)、高敏型化學發光檢測試劑盒(雅酶,中國)、超純RNA提取試劑盒(康為世紀,中國)、逆轉錄試劑盒(東洋坊,日本)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(Qiagen,德國)、脂質體fectamine3000(Invitrogen,美國)、BKCa通道α亞基過表達重組質粒(CMV/KCNMA1/IRES/acGFP1)。

1.2 實驗取材

選取于2015年6月—2016年12月在西南醫科大學附屬醫院心臟大血管外科行體外循環手術的27例風濕性心臟病患者,手術期間對右心房組織進行取材。患者納入標準:(1)確診為風濕性心臟病;(2)心電圖提示為竇性心律;(3)具有外科手術指征;(4)患者與家屬同意手術治療。排除標準:(1)排除心肌梗死引起的瓣膜病變;(2)老年退化性心臟瓣膜病;(3)糖尿病;(4)高血壓;(5)動脈粥樣硬化;(6)肺動脈高壓;(7)房顫;(8)其他:感染性心內膜炎、大血管病變、結締組織病、惡性腫瘤等。

1.3 原代人心房成纖維細胞的分離培養與鑒定

在無菌操作臺取出新鮮的人右心房組織,標準流程處理后加0.1%Ⅱ型膠原酶將其消化至膨松絮狀為止,收集細胞,以優化組織塊貼壁法[13]培養成纖維細胞,即使用0.01%Ⅱ型膠原酶消化結締組織中的膠原蛋白,將消化下來的膠原蛋白及結締組織去除,更利于組織塊貼壁,同時提高培養基中血清比例(20%),以增強細胞增殖能力。將分離的成纖維細胞進行細胞接種、傳代,培養至70%以上后分別對波形蛋白(成纖維細胞標志物)與肌鈣蛋白(心肌細胞標志物)進行免疫熒光染色。

1.4 人心房成纖維細胞模型的建立

使用Ang Ⅱ對人心房成纖維細胞進行建模,將Ang Ⅱ加入細胞培養液,終濃度為500 nmol/L,處理時間為24 h,每隔12 h換液一次。

1.5 實時熒光定量PCR

引物序列見表1。根據超純RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA,用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水稀釋至50 μL。經核酸電泳檢測RNA完整性,ND-1000軟件測純度及濃度,隨后按照說明書進行逆轉錄。按照qRT-PCR試劑盒說明書對cDNA進行擴增,反應條件為:95 ℃,2 min;95 ℃,15 s;57 ℃,30 s,循環40次。采用2-△△CT值的方法分析目的基因的表達水平。

表1 主要引物序列

1.6 蛋白質印跡法

細胞沉淀加入放射免疫沉淀實驗裂解液裂解,冰上孵育30 min,每隔5 min進行15 s振蕩或用1 mL無菌注射器反復吹打數次。孵育結束后,離心(12 000 g,4 ℃,15 min)得到上清。通過二喹啉甲酸法對蛋白濃度進行測定。制備5%濃縮膠及10%分離膠,先以70 V電泳,待樣品電泳至分離膠,轉120 V繼續電泳40 min,以恒壓100 V轉膜1 h,轉至聚偏氟乙烯膜上,轉膜結束對膜洗滌1次,時間3 min,之后以5%脫脂牛奶室溫下封閉1.5 h,稀釋BKCa通道抗體(1：1 000)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(1：1 000)、collagenⅠ抗體(1：1 000)、collagenⅢ抗體(1：1 000),4 ℃孵育過夜。洗膜,加二抗(1：2 000),室溫下孵育1.5 h。洗膜3次,每次10 min,洗膜后將膜浸入現配的高敏型化學發光顯影液,成像系統曝光顯影,用Image J軟件分析灰度值并記錄。

1.7 BKCa通道α亞基過表達重組質粒的轉染

人心房成纖維細胞培養至90%匯合度進行轉染,分別使用OPTI-MEM培養基稀釋質粒DNA(CMV/ KCNMA1/IRES/acGFP1)與Lipofectamine 3000 (脂質體3000),室溫下靜置孵育5 min,隨后將二者混合,室溫孵育20 min。將細胞分為對照組(不做轉染)、過表達BKCa組(wt-BKCa組)和空載組(Vector組)分別進行處理。轉染后培養12 h更換新的培養液,繼續培養24～40 h后在熒光顯微鏡下檢測轉染效果,并篩選穩轉細胞用于后續實驗。

1.8 全細胞膜片鉗技術

使用濃度為200 nmol/L 的BKCa通道特異性阻斷劑Iberiotoxin(IBTX)明確成纖維細胞上是否存在功能正常的BKCa通道,AngⅡ預處理用于探究其對BKCa通道的作用。全細胞膜片鉗技術用于檢測BKCa通道的電流變化,操縱微推進器,控制微管電極與人心房成纖維細胞表面貼附,可見示波器上應答電流減小,此時稍微增加負壓(10～20 cm H2O),緩慢增加負壓過程中可見示波器上應答電流逐漸下降至0,表明已經形成高阻封接(阻抗10 GΩ以上),即已形成全細胞膜片。全細胞膜片鉗記錄:鉗制電壓為-60 mV,測試電壓從-60 mV去極化到+60 mV,脈沖階躍為+10 mV,脈沖時程為300 ms,采樣頻率為10 kHz。

1.9 統計學分析方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析,計量資料中服從正態分布的變量以平均值±標準差描述,兩組之間采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代人心房成纖維細胞的分離培養與鑒定

心房組織在培養皿中呈黑色團塊,4～5 d后,可見細胞從組織塊邊緣爬出(圖1A),并逐漸生長為星狀或放射狀,不規則排列(圖1B),細胞核呈橢圓形傳代培養后的人心房成纖維細胞穩定生長,形態良好,免疫熒光染色顯示對照組僅能見到藍色細胞核(圖1C)。實驗組細胞質呈紅色絲狀,表示波形蛋白表達陽性(圖1D),表明本研究中所分離培養細胞為人心房成纖維細胞;肌鈣蛋白染色組僅能見到藍色的細胞核(圖1E),故可排除心肌細胞的干擾,表明提取的人心房成纖維細胞純度較高。

注: A和B,原代成纖維細胞(20倍和40倍);C,對照組波形蛋白陰性;D,實驗組波形蛋白陽性;E,肌鈣蛋白染色陰性(20 倍)。

2.2 AngⅡ促進人心房成纖維細胞的纖維化

使用AngⅡ處理人心房成纖維細胞進行肌成纖維細胞模型的建立,qRT-PCR結果顯示,在mRNA水平,AngⅡ組的α-SMA、collagenⅠ和collagen Ⅲ較對照組明顯升高(圖2A、2B、2C,P<0.05);蛋白質印跡法結果顯示,在蛋白表達水平,AngⅡ組的α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ也較對照組明顯升高(圖2D、2E、2F,P<0.05)。α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ作為公認的纖維化標志物,在AngⅡ組中明顯上調提示了AngⅡ在人心房成纖維細胞中具有致纖維化作用,纖維化模型建立成功。

注:A～C,AngⅡ上調人心房成纖維細胞上α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ的mRNA表達水平,內參為β-肌動蛋白;D～F,AngⅡ上調人心房成纖維細胞上α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ蛋白表達,內參為GAPDH;與對照組比較,?表示P<0.05,??表示P<0.01。con,對照組;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

A和B,AngⅡ抑制人心房成纖維細胞上BKCa通道 α亞基和 β亞基mRNA表達,內參為β-肌動蛋白;C和D,AngⅡ下調人心房成纖維細胞BKCa通道 α亞基和 β亞基蛋白表達,內參為GAPDH;與對照組比較,?表示P<0.05,??表示P<0.01。con,對照組;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

2.3 Ang Ⅱ抑制人心房成纖維細胞上BKCa通道的表達

為明確AngⅡ的處理是否可調控BKCa通道的表達,本研究在mRNA與蛋白質水平對BKCa通道的表達情況進行了驗證,結果顯示,在mRNA水平,AngⅡ處理后人心房成纖維細胞中的BKCa通道α亞基及β亞基較對照組明顯降低(P<0.05);在蛋白表達水平,AngⅡ組的BKCa通道α亞基及β亞基也明顯降低(P<0.05)。結果表明,AngⅡ在促進人心房成纖維細胞纖維化的同時,抑制了BKCa通道的表達。

2.4 AngⅡ抑制人心房成纖維細胞上BKCa通道的電流密度

全細胞膜片鉗結果顯示,抑制劑IBTX處理后BKCa通道混合電流較對照組明顯減小(圖4A、4B),而隨著去極化電壓的升高,BKCa通道電流幅值也隨之升高(圖4C),表明人心房成纖維細胞存在功能正常的BKCa通道,具有電壓依賴性。

注:A,無IBTX處理對照組(n=5);B,IBTX 200 nmol/L(n=6);C,IBTX 作用后電流-電壓關系曲線;D,無AngⅡ處理對照組(n=5);E,AngⅡ1 μmol/L(n=4);F,AngⅡ作用后的電流-電壓關系曲線;與對照組比較,?P<0.05,??P<0.01。

此外,AngⅡ預處理24 h后可明顯抑制成纖維細胞上BKCa通道的宏觀電流幅度,在+60 mV電壓時,BKCa通道電流密度從31.054±2.900下降到13.508±3.000(圖4D～4F),表明AngⅡ對人心房成纖維細胞上的BKCa通道電流密度具有抑制作用。綜上,AngⅡ不僅抑制了BKCa通道的表達,還對其功能起到了明顯的抑制作用。

2.5 BKCa通道α亞基的過表達抑制了人心房成纖維細胞的纖維化

為明確BKCa通道的表達和功能變化是否對人心房成纖維細胞的纖維化有影響,本研究對BKCa通道的功能性亞基(α亞基)進行過表達。結果顯示,在mRNA水平,wt-BKCa組的α-SMA、collagenⅠ和collagen Ⅲ較對照組和Vector組均明顯降低(圖5A～5C,P<0.05);在蛋白表達水平,wt-BKCa組的α-SMA、collagenⅠ和collagen Ⅲ較對照組和Vector組也明顯降低(圖5D～5F,P<0.05);提示在人心房成纖維細胞中,BKCa通道α亞基的高表達可以有效抑制其纖維化。

注:A～C,BKCa通道 α亞基過表達下調人心房成纖維細胞α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ的mRNA表達水平,內參為β-肌動蛋白;D～F,BKCa通道 α亞基過表達下調人心房成纖維細胞上α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ的蛋白表達水平,內參為GAPDH;與對照組比較,?表示P<0.05,??表示P<0.01。con,對照組;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

3 討論

本研究以人類原代心房成纖維細胞為研究對象,使用AngⅡ處理成功構建了纖維化模型,檢測到細胞中纖維化指標α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的mRNA和蛋白質的表達明顯上調,同時,AngⅡ的處理抑制了人心房成纖維細胞中BKCa通道的表達和功能。隨后通過過表達人心房成纖維細胞的BKCa通道證實了該通道在人心房成纖維細胞中的高表達能有效抑制其纖維化標志物的表達,證明其對纖維化具有保護作用。因此,本研究認為,AngⅡ可能通過抑制BKCa通道的表達和功能來促進人心房成纖維細胞的纖維化。

既往的研究已證實BKCa通道在血管平滑肌細胞[14]、心肌成纖維細胞[15]和內皮細胞[16-17]的質膜中普遍表達并發揮其功能,但目前關于BKCa通道的研究尚不完整,BKCa通道在不同的細胞系、不同的疾病模型中起到的作用可能會不同。例如,Wen等[6]的研究認為,Ang Ⅱ可以增加血管平滑肌細胞的BKCa通道活化,這與本研究結果相反,可能是由于使用的細胞類型不同導致,而BKCa通道在不同的疾病中也可能表現出完全不同的功能。此外,有研究[18-19]表明一氧化氮通過激活BKCa通道從而誘導血管平滑肌細胞的凋亡,而Ang Ⅱ通過抑制BKCa通道的表達促進血管平滑肌細胞的增殖。而在乳腺癌細胞上,有報道[20]稱BKCa通道的激活促進了乳腺癌細胞的增殖[21]、遷移及侵襲。而另一些研究[22]表明,使用BKCa通道特異性阻斷劑IBTX對乳腺癌細胞的增殖無明顯作用。

類似的,在心血管領域,Sheng等[23]的研究表明,BKCa通道活性可被硫化氫抑制,進而減弱人心房成纖維細胞增殖和分化。Li等[15]的研究報道,使用干擾小RNA在人心室肌成纖維細胞上抑制BKCa通道表達后,人心室成纖維細胞的增殖和分化會被抑制,這與本研究結果相反,這可能是由于不同實驗室所使用的細胞來源不同導致的。但Jakob等[12]研究指出,房顫患者右心房成纖維細胞與竇性心律患者右心房成纖維細胞相比,BKCa通道活性較低,提示該通道在房顫的右心房成纖維細胞中受到了抑制,這與筆者團隊的結論相符。

本研究證實了BKCa通道表達和功能的增強可抑制AngⅡ誘導的成纖維細胞纖維化,但BKCa通道與纖維化之間是否存在其他下游通路、BKCa通道電流的變化如何影響纖維化尚不得而知,存在一定局限性,需在后續的研究中進一步探索。綜上所述,BKCa通道影響成纖維細胞的增殖過程是較為明確的,本研究結果進一步表明AngⅡ處理可通過抑制BKCa通道α亞基和β亞基的表達和功能來促進成纖維細胞的纖維化,并可能借此參與房顫的發生。