NLRP3炎癥小體介導氧化三甲胺加速動脈粥樣硬化的新進展

趙海燕 關秀茹

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院檢驗科,黑龍江 哈爾濱 150001)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是引發人類心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的共同病理基礎。其血管壁易損斑塊的形成和破裂是CVD患者殘疾或死亡的主要原因,嚴重威脅老年人群的生命健康安全[1]。長久以來的研究顯示,AS的病理機制主要包括內皮細胞損傷學說、炎癥反應學說和脂質浸潤學說。其中,炎癥反應學說最早形成,也貫穿早期斑塊形成和晚期斑塊破裂的整個過程。該學說認為當血管內皮受損時,巨噬細胞作為最主要的免疫細胞接受細胞損傷信號后遷移至內皮下細胞間隙,吞噬沉積的脂質顆粒,形成泡沫細胞并釋放炎癥因子。后者一方面激活凋亡抑制因子,阻斷早期斑塊內巨噬細胞凋亡過程,干擾斑塊清除程序的正常運行,擴大斑塊面積;另一方面,局部聚集的炎癥因子如白細胞介素(interleukin,IL)-6和IL-18也可加速B淋巴細胞、T淋巴細胞和單核巨噬細胞中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9的合成釋放,降解纖維帽內膠原纖維,加速斑塊不穩定[2-4]。斑塊破裂后,炎癥因子釋放入血,通過上調促凝物質的表達或促進纖溶酶原激活物抑制物-1的合成加速血栓形成,嚴重時血栓脫落阻塞管腔,引發心腦血管意外。由此可見,粥樣斑塊內級聯放大的炎癥反應不僅是斑塊形成的核心機制,更是加速壞死核心擴張、纖維帽變薄、斑塊破裂和血栓形成的重要推動因素。明確引發巨噬細胞炎癥的機制是緩解斑塊進展的重要前提,也是防治AS的關鍵一環。

1 NOD樣受體蛋白3炎癥小體

1.1 NOD樣受體蛋白3炎癥小體結構

NOD樣受體蛋白(NOD-like receptor protein,NLRP)家族是一大類介導細胞炎癥反應的炎癥小體,目前廣泛研究的主要有NLRP1～NLRP14。其中,NLRP3炎癥小體目前研究最為透徹、機制最為復雜,在多種炎癥性疾病的機制研究中廣受關注。學界對NLRP3炎癥小體的研究始于Hoffman等[5]對NLRP3蛋白結構的確立,作者認為NLRP3蛋白主要由富含亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat,LRR)的C端,含熱蛋白結構域(pyrin domain,PYD)的N端和中心核苷酸寡聚化結構域(nucleoside triphosphatase domain,NACHT)組成,并在先天免疫反應和炎癥等方面發揮重要作用。隨著研究工作的深入,Martinon等[6]確定NLRP3介導上述作用的發揮并非獨立完成,而是依賴含有CARD的凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)的銜接,胱天蛋白酶-1(caspase-1)的激活和IL-1β、IL-18的釋放,Tschopp研究小組基于此首次提出NLRP3炎癥小體的概念,并將其定義為caspase的激活復合物。

1.2 NLRP3炎癥小體的激活過程

靜息狀態時,NLRP3中LRR結構折疊至NACHT上維持其抑制狀態。一旦細胞受到氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)、脂多糖等刺激,NLRP3發生構象改變,去除LRR,識別配體并發生自身寡聚,隨后其N端PYD與ASC中N端PYD結合;利用ASC的C端caspase募集結構域募集caspase-1前體,實現NLRP3炎癥小體的組裝。隨后局部高濃度的caspase-1前體暴露酶切位點并發生自體剪切,剪切產物p20亞基和p10亞基結合為異質四聚體,形成具有水解酶活性的caspase-1,啟動炎癥或焦亡:一方面caspase-1可剪切IL-1β和IL-18前體形成有活性的IL-1β和IL-18成熟體,介導細胞炎癥;另一方面,caspase-1也能切割執行蛋白GSDMD,生成N端(GSDMD-N)和C端(GSDMD-C)兩個獨立片段,前者可轉移至細胞質膜附近并與膜磷脂特異性結合,形成胞膜孔道并破壞膜完整性,提高滲透性,引發細胞焦亡[7]。此外,細胞膜破裂可加速細胞中IL-1β、IL-18、TNF-α和乳酸脫氫酶等內容物的釋放,放大炎癥風暴[8]。

2 NLRP3炎癥小體與AS

AS是一種好發于心血管系統的無菌性炎癥性病變。NLRP3炎癥小體的激活和IL-1β的釋放作為典型“無菌性炎癥”的重要環節,似乎與AS之間存在著緊密而復雜的聯系。

2.1 NLRP3炎癥小體在AS斑塊中的差異性表達

作為炎癥信號的主要傳感器,脂質代謝異常也是啟動NLRP3炎癥小體、激活caspase-1和加速AS發展的重要觸發器。2010年,Duewell等[9]發現了NLRP3炎癥小體與AS之間聯系的直接證據,研究顯示ox-LDL通過誘導膽固醇結晶化使其作為內源性信號分子激活巨噬細胞NLRP3炎癥小體,促進炎癥因子IL-1β的成熟與釋放,介導AS早期炎癥反應。部分流行病學調查和動物實驗研究也為NLRP3炎癥小體激活參與AS疾病的病理學機制提供了有力的支持。一項涉及555例心肌梗死患者和1 016例健康人群的DNA分析研究[10]發現,頸動脈粥樣斑塊NLRP3炎癥小體通路相關蛋白的基因水平較正常動脈明顯升高,且在有癥狀的AS患者中升高更為顯著。Shi等[11]分析30例頸動脈內膜剝脫術患者頸AS斑塊、10例腸癌患者的腸系膜動脈和20例無動脈狹窄者后認為,這種差異性表達往往與斑塊穩定性直接相關,與穩定斑塊相比,易損斑塊中NLRP3炎癥小體表達水平往往更高。沉默或抑制載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因敲除(ApoE-/-)小鼠NLRP3基因可有效降低斑塊內IL-1β和TNF-α水平,縮小頸動脈斑塊面積,增加斑塊纖維帽的厚度及膠原比例,改善斑塊穩定性[12-13]。因此,NLRP3炎癥小體激活不僅參與粥樣斑塊形成,更是斑塊不穩定的核心推動者,可被視為不良心血管事件的主要預測因子,用以評估CVD患者預后。靶向NLRP3炎癥小體的活性調節可能是AS防治的潛在措施,明確NLRP3炎癥小體激活機制對AS的防治至關重要。

2.2 粥樣硬化斑塊內NLRP3炎癥小體激活的機制通路

NLRP3炎癥小體的激活過程復雜,盡管目前其激活機制尚未徹底闡明,但近幾十年來的研究證明,NLRP3炎癥小體的激活往往伴隨核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、內質網應激等信號的異常表達。NF-κB是一種與炎癥密切相關的轉錄激活因子,是炎癥過程的重要調節樞紐,通過與核內DNA融合調控細胞炎癥分子的表達。基礎狀態下,失活的NF-κB與NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)以三聚體形式存在于細胞質中,共同平衡細胞炎癥水平;當外界刺激發生時,刺激信號經IκB激酶級聯激活形成活性IκB激酶,后者通過泛素化或磷酸化IκB蛋白使NF-κB二聚體從中解離,活化并入核與NLRP3等靶基因結合,從而調控相關基因和蛋白的表達,參與宿主免疫、炎癥、細胞增殖和凋亡等多種生物學過程[14]。既往大量體外研究[15]發現,高水平ox-LDL經膜受體Toll樣受體4識別后可激活NF-κB磷酸化,促進NLRP3、IL-18等炎癥因子的轉錄和表達。類似的是,Li等[16]的研究也認為高濃度ox-LDL激活巨噬細胞中NLRP3炎癥小體和啟動細胞焦亡的機制可能與NF-κB/三磷酸腺苷結合盒轉運體通路的過度激活直接相關。

另外,除直接激活NF-κB通路外,MAPK、內質網應激等信號通路的激活也可作為ox-LDL等損傷相關分子模式間接誘導NF-κB磷酸化、實現NLRP3炎癥小體激活和細胞炎癥反應的有效機制。MAPK是一類存儲于細胞質內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要包含3大分支:細胞外信號調控的激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)通路、c-Jun氨基端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)通路、p38 MAPK通路。其中,p38 MAPK與JNK通路主要參與細胞凋亡和分化;ERK通路主要介導細胞有絲分裂和增殖[17]。AS患者血管壁炎癥性斑塊形成往往伴有MAPK及其下游炎癥信號的異常激活。一項臨床研究[18]分析了來自20個人類早期、中期和晚期冠狀動脈粥樣斑塊樣本中caspase-1、ASC、IL-18和p38 MAPK基因含量,研究發現晚期AS斑塊中顯著上調的caspase-1、ASC和IL-18基因往往伴隨著更高水平的p38 MAPK基因表達,在病變巨噬細胞和泡沫細胞中尤其強烈。部分實驗[19]體外給予過量ox-LDL刺激樹突狀細胞發現,細胞內p38 MAPK和NF-κB通路異常激活。基于此,部分中藥制劑利用其抑制p38 MAPK和NF-κB磷酸化的作用有效降低斑塊和細胞內NLRP3炎癥水平,減少血管炎癥、血管損傷等糖尿病并發癥的發生[20]。故p38 MAPK/NF-κB信號軸可能是介導斑塊或細胞NLRP3炎癥小體激活的可能機制之一。

另外,內質網應激作為AS的共同病理機制,似乎也與炎癥存在密不可分的聯系,主要表現為內質網應激中蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)和肌醇依賴酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)兩大分支與NF-κB之間的串擾。研究[21]顯示,IRE1通過激活TNF受體相關因子2啟動JNK或NF-κB信號,參與細胞功能障礙和凋亡;PERK則可借助其下游的真核翻譯起始因子2α降低IκB的轉錄水平,提高NF-κB途徑激活程度,誘導炎性基因的表達。部分研究[22]使用內質網應激抑制劑4-苯基丁酸處理血管內皮細胞發現,內質網應激的抑制可有效緩解細胞中NF-κB激活程度,并降低IL-16和IL-8的釋放。一項使用阿托伐他汀處理ApoE-/-小鼠的動物研究[23]發現,斑塊內葡萄糖調節蛋白78和PERK水平顯著降低,NF-κB激活程度也隨之下降,斑塊病變面積顯著減少。進一步研究[24]顯示,內質網應激和下游NF-κB信號通路的激活可能來源于細胞內活性氧的過度蓄積,升高細胞內血紅素加氧酶-1和沉默調節蛋白1的表達,可有效抑制內質網應激和下游NF-κB水平,細胞內細胞間黏附分子、血管細胞黏附分子等表達也隨之下降。綜上所述,NF-κB、內質網應激、p38 MAPK和活性氧等信號通路途徑作為NLRP3炎癥小體激活的重要調節信號,在ox-LDL誘導的巨噬細胞炎癥中發揮重要的核心和推動作用。

3 氧化三甲胺

3.1 氧化三甲胺概述

氧化三甲胺(trimethylamine oxide,TMAO)是一種依賴腸道菌群產生的主要代謝產物,紅肉、雞蛋中富含的卵磷脂、膽堿和L-肉堿是血漿中TMAO的主要物質來源,經腸道菌群和各種裂解酶的催化生成三甲胺(trimethylamine,TMA),后者經腸道重吸收入肝后,被肝內黃素單加氧酶3(flavin-containing monooxygenase 3,FMO3)氧化生成TMAO;少數TMAO也可從魚等海洋食物中直接攝取[25]。除飲食因素的影響外,腸道菌群的組成、肝酶活性和腎臟排泄能力等多種因素也可決定血漿TMAO水平。腸道菌群紊亂對TMAO水平和機體健康有著十分重要的影響。既往大量基因組學分析表明,膽堿代謝相關基因廣泛分布于變形桿菌門、厚壁菌門和放線菌門,而擬桿菌門則主要與膽堿代謝和TMAO水平呈負相關,由于AS人群其腸道內擬桿菌門/厚壁菌門往往低于正常組,因此AS患者常伴隨高濃度的TMAO。基于此,多數臨床措施通過使用益生菌調整腸道菌群的結構,降低腸道菌群TMA轉化能力,下調血漿TMAO水平,抑制AS進展[26]。盡管菌群種類在TMAO生產中發揮重要作用,但究其源頭,一條存在于厚壁菌門和放線菌門等細菌的通路,包含4種參與TMA合成的酶,即裂解膽堿的膽堿-TMA裂解酶(cutC/D)、代謝左旋肉堿的肉堿單氧化酶(cntA/B和yeaW/X)、參與甜菜堿轉化的甜菜堿還原酶(grdH)和TMAO合成酶FMO3,似乎才是影響TMAO水平的關鍵。基于此,部分研究[27-28]通過抑制FMO3或TMA裂解酶活性而不影響菌群構成,阻礙TMA-TMAO的體內轉化過程,有效降低TMAO水平,阻斷CVD的進展。最后,血液中絕大部分TMAO都會經腎臟隨尿液排出體外,因此尿液TMAO水平常可作為評估腎臟損傷的指標之一。

3.2 TMAO與AS

近些年來,關于TMAO與CVD及其并發癥之間的聯系越來越受到重視。多數流行病學調查發現,TMAO濃度的升高可顯著增加AS患病風險,已被視為AS疾病進展的新型生物標志物。體內實驗[29]通過給予小鼠膽堿喂養或直接飼喂TMAO發現,補充TMAO膳食可促進AS斑塊形成。一項涉及4 007例受試者的前瞻性隊列研究[30]也顯示,在具有同等CVD危險因素的患者中,循環TMAO水平更高的人群往往發生AS的可能性更大。部分動物實驗[28]通過使用3,3-二甲基-1-丁醇預處理小鼠發現,處理組小鼠血清中TMAO的水平顯著降低,動脈斑塊面積顯著減少。除可預測AS患病風險外,TMAO水平的升高也與CVD患者預后不良緊密相關。關于血漿TMAO水平與冠心病患者預后的meta分析[31-32]比較了不同患者TMAO水平后發現,循環TMAO水平與冠心病預后情況存在劑量依賴性,當血漿TMAO水平>5 μmol/L時,隨著循環TMAO水平升高,不良心血管事件發生率逐步增加,盡管去除傳統心血管危險因素的影響,風險值依舊穩定。大量臨床研究[33]通過分析冠心病患者和正常人群血漿中TMAO水平、血管壁粥樣斑塊纖維帽厚度和頸動脈內-中膜厚度的相關性證實了這一觀點,高水平TMAO組患者往往具有更薄的斑塊纖維帽,更易發生斑塊破裂,出現血栓和不良心血管事件。綜上所述,TMAO與粥樣硬化斑塊不穩定緊密相關,其血清水平的監測為冠心病患者預后觀察提供了有力支持。

3.3 NLRP3炎癥小體介導TMAO加速AS進展

盡管多數研究證實膽固醇代謝障礙、膽汁酸代謝紊亂和血小板活性調節等途徑在循環高水平TMAO加速AS進展中發揮關鍵作用,但近幾年的報道越來越強調TMAO誘導血管炎癥在加速粥樣硬化斑塊進程中的重要性。部分針對內皮細胞的實驗[34]表明,TMAO刺激可顯著增加細胞內NLRP3與ASC/caspase-1的共定位、caspase-1活性、IL-1β釋放及內皮細胞通透性,而caspase-1抑制劑WEHD或NLRP3小干擾RNA的預處理則有效減輕內皮細胞通透性和功能障礙,提示NLRP3炎癥小體的形成和激活可能是TMAO誘導血管內皮炎癥反應和內皮功能障礙的重要啟動機制。通過給8周齡ApoE-/-小鼠高脂飲食構建AS,行頸部脫位處死后可見其血管內膜斑塊形成,主動脈內IL-1β和MMP-9水平升高;而加飼1%膽堿4周后,小鼠血管內IL-1β、MMP-9和細胞間黏附分子-1水平更高,斑塊體積更大,機制研究與上述TMAO激活內皮細胞NLRP3炎癥小體反應的觀點一致[35]。多項AS動物模型研究也表明,TMAO刺激可有效促進AS發生發展過程中平滑肌鈣化和新生血管形成,加速斑塊不穩定性。Chen等[36]利用部分頸動脈結扎建立急性血流擾動誘導的AS模型發現,3,3-二甲基-1-丁醇處理可顯著逆轉高膽堿喂養小鼠動脈粥樣斑塊內新生內膜增生和斑塊進展,機制研究顯示與TMAO加速平滑肌細胞內NLRP3炎癥小體表達、提高內質網應激水平和活性氧含量有必然聯系。此外,TMAO也可促進血管平滑肌細胞NLRP3炎癥小體加速,參與血管鈣化,加速慢性腎臟病的進展[37]。基于以上研究不難發現,TMAO誘導NLRP3炎癥小體的異常激活是AS研究領域十分值得關注的話題。但多數研究主要聚焦于TMAO與內皮細胞和平滑肌細胞功能障礙領域,而關于巨噬細胞的研究目前僅在移植物抗宿主病的細胞極化中有所涉及,在AS領域仍有待進一步深入。

4 結語與展望

NLRP3炎癥小體是加速AS斑塊進展、誘導斑塊不穩定的重要因素。如圖1所示,目前的研究已證實循環高濃度TMAO可促進內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞內NLRP3炎癥小體激活,加速血管炎癥和 AS進展。充分利用這一機制并相應地調節NLRP3炎癥小體的表達可有效緩解AS進展、穩定斑塊,這是當前AS防治領域的重要措施。但值得一提的是,由于目前的研究主要集中于內皮細胞和平滑肌細胞領域,故在巨噬細胞源性泡沫細胞中的研究仍有待深入。總而言之,探究斑塊中NLRP3炎癥小體的激活是研究TMAO加速AS進展的重要靶點,這也為未來調節NLRP3炎癥小體防治AS提供了重要突破口。

圖1 NLRP3炎癥小體介導TMAO加速AS的新進展