萊菔硫烷降低尿酸鈉誘導成骨細胞的炎癥和氧化應激反應

陳巧鳳 施建輝 羅昌林

1.福建醫科大學附屬泉州第一醫院骨科,福建 泉州 362000 2.福建醫科大學,福建 福州 362002

痛風性關節炎的發生與關節內外軟組織和骨骼對尿酸鈉鹽(monosodium urate,MSU)沉積產生的炎癥和氧化應激反應密切相關。炎癥反復及間歇性的發作可產生慢性痛風性關節炎,導致關節軟骨和骨骼破壞,隨著疾病的發展甚至可能出現局部骨質疏松[1]。晶體誘導的關節炎癥和應激反應涉及關節周圍組織中的多種類型細胞加入,包括單核細胞、巨噬細胞和滑膜細胞,這些細胞的產生會增加其他促炎細胞因子(如IL-1β和IL-6)的釋放,導致關節組織受損。痛風性關節炎可檢測到關節周圍骨侵蝕和軟骨丟失等代謝性變化,以及代謝性新骨形成[2]。成骨細胞的生存能力是骨重建的限速步驟,成骨細胞數量和功能與MSU的刺激有關[3]。

飲食習慣、痛風的病理特點以及有限的治療方法使痛風的治療具有挑戰性。因此,人類正在積極研究痛風的發病機制和尋找有效的治療方法[4]。急性痛風的有效治療方法包括秋水仙堿、非甾體抗炎藥、別嘌醇、非布司他等,但這些藥物可能引起肝腎功能損傷、胃腸道反應等副作用[5]。因此,尋找低毒、安全、有效的天然化合物已成為痛風治療的研究重點之一[6]。

萊菔硫烷(sulforaphane,SFN)是從花椰菜和西蘭花等蔬菜中提取的一種活性成分。由于其在Nrf2激活中的特殊能力,SFN被認為是Nrf2的激活劑,并被視為預防和(或)治療氧化應激相關疾病的補充劑。SFN是核因子紅系2相關因子2(Nrf2)抗氧化反應元件(ARE)遺傳途徑的有效激活劑。Nrf2-ARE的上調增加了多種抗氧化劑的可用性,這些抗氧化劑在細胞氧化還原平衡和抗氧化刺激保護中起著關鍵作用。SFN降低了許多疾病的風險以及氧化應激和炎癥條件下的癥狀負擔[7]。然而,關于SFN影響痛風性關節炎的研究很少,尤其是那些伴有骨破壞的關節炎。本研究旨在評估SFN對MSU誘導的成骨細胞損傷的作用,這可能是預防和治療痛風患者骨侵蝕的一種方法。

1 材料與方法

1.1 成骨細胞的培養

將細胞接種到25 cm2的細胞培養瓶中,加入4～5 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養基。細胞在37 ℃和5% CO2的培養箱中培養。每天觀察細胞狀態,每天更換一次細胞培養基,每3 d傳代一次。

1.2 CCK-8檢測MSU和SFN對UMR-106細胞活力的影響

1.2.1成骨細胞接種:采用CCK-8法檢測UMR-106細胞的活力和增殖情況。將細胞計數調整為3×103個/孔,將其接種到96孔板中,并在37 ℃和5% CO2加濕條件下孵育。在細胞完全貼壁后,吸出完整的培養基并加入無血清培養基,并保持細胞培養24 h。

1.2.2血清干預:在培養基中分別加入MSU(10、50、100、300、500 μg/mL)和SFN(1、5、10、20、50 μmol/L),不同濃度的每種藥物6個孔。

1.2.3CCK8添加:向每個孔中加入10 μL CCK8,在37 ℃的細胞培養箱中連續培養4 h。

1.2.4OD值檢測:采用標準化酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞活力。將96孔板放入酶聯免疫吸附試驗中,打開計算機并按照說明進行操作,檢測OD值。根據吸光度值,比較不同濃度的含藥血清和模型血清對細胞增殖的影響,確定最佳含藥血清濃度。

1.3 細胞內ROS檢測

設置0 μg/mL MSU+0 μmol/L SFN組為CON組,300 μg/mL MSU+0 μmol/L SFN組為MSU組,使用ROS敏感的熒光探針2',7'-二氯二氫熒光素二乙酯(DCFH-DA)檢測細胞內ROS。根據實驗要求對細胞進行分組后,對其進行常規消化,收集細胞沉淀物,并制備細胞懸浮液。用無血清培養基以1∶1 000的比例稀釋DCFH-DA,以達到10 μmol/L的所需工作濃度。收集后將細胞懸浮在稀釋的DCFH-DA中,并在37 ℃的細胞培養箱中孵育20 min。每隔3～5 min將其倒置混合一次,以確保探針與細胞完全接觸。使用PBS洗滌來去除未進入細胞的DCFH-DA。采用488 nm激發波長和525 nm發射波長,熒光強度作為熒光分光光度計。對照組的熒光強度為100%,并將其他各組與對照組進行比較,以計算細胞內ROS的變化。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

用胰蛋白酶消化收集培養的UMR-106細胞。細胞用預冷的PBS洗滌3次,并在4 ℃和1 000 r/min下離心5 min;將上清液丟棄。然后用1 mL結合緩沖液洗滌細胞,并在4 ℃和1 000 r/min下離心5 min;將上清液丟棄。然后加入100 μL的結合緩沖液重懸細胞,加入5 μL的PI和5 μL的FITC膜聯蛋白V混合均勻,在26 ℃的黑暗中孵育15 min,與400 μL的結合緩沖劑混合,并立即用流式細胞儀盡快檢測[8]。

1.5 細胞標記蛋白表達的檢測

在培養基中加入10 μmol/L SFN和300 μmol/L MSU 48 h后,用常規細胞裂解液收集UMR-106細胞并獲得蛋白質。蛋白質離心和濃度測定采用BCA法。將制備的粘合劑和30 μg蛋白質加熱變性,加載并電泳檢測。在70 V電壓和110 V電壓下作用30 min后,切割粘合劑并轉移膜,在60 V電壓下作用2 h后密封膜。將膜與Nrf2、HO-1、HIF-1、IL-6和caspase-3的一級抗體(1∶200)孵育1 h,用TBST洗脫3次(每次15 min)。加入第二種抗體,以(1∶1 000)稀釋,用于洗脫、化學發光、顯影和固定。β-actin作為內部參考,并使用圖像分析系統對結果進行分析。

1.6 統計學分析

使用SPSS 20.0軟件進行統計分析,測量數據用平均值±標準差表示。兩組之間使用t檢驗進行比較,多組之間使用單向方差分析進行比較,成對比較使用Bonferroni調整的t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSU降低成骨細胞的活性

MSU對成骨細胞活性的毒性作用隨著濃度和時間的增加而增加,當濃度為300 μg/mL,反應時間48 h時,細胞活力低于50%。本研究選擇濃度為300 μg/mL的MSU作為成骨細胞損傷作用濃度,48 h作為細胞損害的作用時間。見圖1。

圖1 不同濃度的MSU降低成骨細胞的活性

2.2 SFN對成骨細胞生存能力的影響

1、5和10 μmol/L濃度的SFN對細胞活力沒有影響,但20 μmol/L和50 μmol/L的SFN顯著降低了細胞活力,尤其是作用時間超過48 h。當SFN濃度為20 μmol/L時,細胞活力降至50%以下。因此,本研究選擇1、5、10 μmol/L作為成骨細胞的實驗濃度,48 h作為實驗時間。見圖2。

圖2 不同濃度的SFN對成骨細胞活力的影響

2.3 SFN降低MSU誘導的成骨細胞ROS水平

SFN降低了MSU引起的ROS水平增加,并且隨著濃度的增加效果越明顯。當SFN濃度為10 μmol/L時,MSU誘導組和未誘導組之間的ROS水平差異沒有統計學意義。見圖3。

圖3 SFN降低MSU誘導的成骨細胞ROS水平

2.4 SFN逆轉MSU誘導的成骨細胞凋亡水平

MSU增加了成骨細胞的凋亡,SFN減少了MSU引起的細胞凋亡,并且隨著SFN濃度的增加效果更好。當SFN濃度為10 μmol/L時,MSU誘導組和未誘導組之間的細胞凋亡差異沒有統計學意義。見圖4。

圖4 SFN逆轉MSU誘導的成骨細胞凋亡水平

2.5 SFN降低MSU誘導的成骨細胞中HIF-1、IL-6、caspase-3蛋白的表達,增加Nrf2、HO-1的蛋白表達

為了進一步驗證SFN對MSU誘導的成骨細胞的影響,本研究檢測了氧化指標(Nrf2、HO-1、HIF-1)、炎癥指標(IL-6)和凋亡指標(caspsae-3)蛋白。發現與MSU組相比,SFN可以降低HIF-1、IL-6和caspase-3蛋白,但增加Nrf2和HO-1蛋白。見圖5。

圖5 SFN對MSU誘導的成骨細胞蛋白質的影響

3 討論

高尿酸血癥在骨質疏松癥中起著重要作用。一些研究表明,高尿酸血癥會導致尿酸降解過程中許多因子過量產生,包括自由氧基、超氧化物和炎性細胞因子[9],這些因子刺激破骨細胞的產生,抑制成骨細胞的形成,增加骨吸收,減少骨形成。高尿酸血癥引起的維生素D缺乏會導致骨質疏松。如果產生過量的嘌呤或尿酸排泄不足,體內的尿酸量就會增加。痛風性關節炎是指過量的尿酸結晶積聚在關節中,并導致關節疼痛和腫脹[10]。促炎細胞因子是介導急性和慢性痛風性關節炎發生的重要分子。研究表明,受痛風影響的關節骨重塑紊亂和骨侵蝕是MSU晶體直接和間接作用的綜合結果。

本研究發現低劑量SFN可以有效降低細胞內ROS水平,并減輕MSU晶體誘導的成骨細胞凋亡。本研究表明,SFN劑量依賴性地削弱了MSU對成骨細胞凋亡水平和細胞內ROS水平的刺激作用,并提高了成骨細胞的活力水平。本研究發現,SFN給藥組Nrf2、HO-1水平升高以及HIF-1、IL-6和caspase-3水平降低同時發生。研究表明,氧化應激和炎癥反應在痛風影響成骨細胞的過程中發揮著重要作用。痛風的病理學非常復雜,涉及多方面的模型,包括炎癥過程、氧化應激和潛在的遺傳影響之間的相互作用。Nrf2在疾病的發展和維持中起著關鍵作用[11]。

SFN是一種來源于十字花科蔬菜的化合物,已被證明是安全無毒的,副作用小,由于其多種生物活性,如抗癌和抗氧化活性,已被廣泛研究[12]。SFN的抗氧化功能是由Nrf2依賴性誘導的血紅素加氧酶-1(HO-1)介導的,它保護細胞免受氧化應激。核轉錄因子Nrf2是細胞抗氧化應激系統中的關鍵轉錄因子[13-14]。Nrf2是一種氧化還原敏感的轉錄因子,通過對血紅素加氧酶-1(HO-1)酶表達/活性的積極影響來調節宿主應激反應,從而導致有效的微生物清除。Nrf-2是氧化反應的重要調節因子,維持組織的正常功能。痛風性關節炎通過Nrf2轉錄因子途徑產生氧化應激反應[15]。痛風誘導NLRP3炎癥小體和Nrf2的激活,Nrf2在細胞氧化應激反應中起保護作用[16]。本研究證實,SFN可以逆轉MSU對成骨細胞的破壞作用,提高成骨細胞存活率和活性[17]。

綜上,SFN可以通過減少細胞炎癥和氧化應激反應來提高MSU誘導的成骨細胞的活性并降低其凋亡水平。