興安升麻醇提物成分分析及基于網絡藥理學探討其促進皮膚傷口愈合的作用機制

李艷娜，張富源，程偉峰，桑亞新，王向紅,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北保定 071000；2.河北雅果食品有限公司，河北保定 071000）

升麻屬植物為毛茛科多年生草本植物，約有10 余種主產于我國各地[1]。升麻在我國是一種常用中藥，也是藥食同源目錄中的一種食物，為大三葉升麻、興安升麻和升麻的干燥根莖。由于其具備成本較低、毒副作用較小、不易產生耐藥性等優點，三個升麻品種均被收錄于2015 年版《中國藥典》[2]。其中，興安升麻又名為苦老芽、窟窿牙，在我國廣泛分布于內蒙古、山西、河北、遼寧和黑龍江等地[3]。作為一種藥用植物，興安升麻具有清熱解毒、發表透疹等功效，常被用于治療咽喉腫痛、風熱頭痛、子宮脫垂等病癥[2]。它又是一種純天然的山野菜，將剛生長出的嫩芽制作后食用，入口微苦、先苦后甜，有良好清熱敗火、抗菌消炎功效，食療效果較好[4-7]，具有較高研究價值。

研究發現，升麻屬植物中富含多種活性成分，具有重要的藥理活性功能，如抗病毒、抗炎、抗骨質疏松、治療婦女更年期綜合癥等[8-10]，在維護人體健康及防治相關疾病方面具有較高的研究價值。升麻屬植物中酚酸類、萜類等化合物是較好的抗炎活性成分，如阿魏酸、異阿魏酸等。我國每年約有超過1000 萬人遭受皮膚創傷，當皮膚受損后，皮膚的完整性及功能性會受到破壞，迫使血管破裂、引發炎癥反應、造成機體的感染，甚至危及生命[11-12]。因此，作為連接機體與外界環境的第一關，快速修復皮膚創傷至關重要[13]。但是傷口愈合的速度及愈合質量會受到諸多因素的影響，其中，傷口炎癥、細菌感染是影響傷口愈合的重要因素之一。前期研究發現，具有良好抗菌消炎作用的興安升麻能夠有效促進傷口愈合，嚴格防止細菌感染[14]，但是由于其成分復雜，對于發揮藥效活性成分群及作用機制尚不清晰。

網絡藥理學是一門多學科技術和內容相結合的交叉學科，通過分析生物網絡解釋藥物成分與疾病靶點之間的復雜關系，并揭示其作用機制[15-16]。Deng等[15]探索了桔梗治療肺癌的潛在作用機制，表明桔梗可能是通過MAPK 和P13K-AKT 等潛在信號通路來治療肺癌。基于網絡藥理學研究發現桃紅四物湯主要通過抑菌作用及改善血液流變學等途徑，治療關節置換后假體周圍感染[17]。因此，基于網絡藥理學方法分析藥物與機體之間的關系已經受到研究者的廣泛關注，逐漸成為研究熱點，但尚未見與基于網絡藥理學預測興安升麻作用機制的相關研究。

由于興安升麻發揮促進皮膚傷口愈合功效的活性成分及作用機制尚不明確，本研究以興安升麻為原料，采用醇提法提取生物活性物質，并通過HPLCMS 技術分析鑒定興安升麻醇提物的活性化學成分。通過網絡藥理學進一步分析預測其促愈作用機制，以期為興安升麻的開發與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

興安升麻（Cimicifuga dahurica(Turcz.) Maxim.） 購于河北省張家口市，多年生草本植物；無水乙醇 純度≥95.0%，天津市富宇精細化工有限公司；乙腈 純度≥99.9%，上海拜力生物科技有限公司；甲酸 色譜純，梯希愛化成工業發展有限公司；甲酸銨 純度≥99.9%，西格瑪奧德里奇貿易有限公司。

RE-52A 型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵 保定高新區陽光科教儀器廠；FD5-2.5 型真空冷凍干燥機 SIM 儀器有限公司；H1850-R 型冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；U3000 型液相色譜儀、QE Focus 高分辨質譜儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 興安升麻活性物質的提取 將興安升麻凍干，粉碎，過60 目篩。稱取5 g 粉末，加入60 mL 78%乙醇混合均勻，在室溫條件下醇提3 次，每次靜置提取12 h。將醇提液合并、過濾，8000 r/min 離心5 min，收集上清液于37 ℃下旋蒸除去乙醇，再經冷凍干燥，最終獲得醇提物干粉。

1.2.2 化學成分的鑒定 通過HPLC-MS 檢測，根據精確分子量及數據庫篩選分析興安升麻醇提物的化學成分，并應用面積歸一法進行定量[18]。

1.2.2.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC? HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）色譜柱，自動進樣器溫度設為8 ℃，以0.25 mL/min 的流速，40 ℃的柱溫，進樣2 μL 進行梯度洗脫，流動相為正離子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；負離子5 mmol/L 甲酸銨水（A）-乙腈（B）。

1.2.2.2 質譜條件 儀器使用電噴霧離子源（ESI），正負離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細管溫度325 ℃，以分辨率70000 進行全掃描，掃描范圍81～1000 aum。

1.2.3 靶點的篩選及預測 利用Pubchem 數據庫獲取興安升麻化學成分的結構，將其導入SwissADME數據庫，以“胃腸道吸收為高且類藥性滿足兩個條件”為標準，并結合文獻篩選出有效成分，并根據靶點可能性通過SwissTargetPrediction 數據庫篩選及預測有效成分的潛在靶點，再利用UniProt 蛋白數據庫篩選出具有相應基因的有效靶點。以“皮膚傷口（skin wound）”為關鍵詞，通過GeneCards、OMIM及DrugBank 數據庫搜索與此相關的疾病靶點。將其與興安升麻的有效靶點進行匹配，得到興安升麻促進皮膚傷口愈合的相關靶點。

1.2.4 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖的構建 采用Cytoscape3.9.0 軟件構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡，并進行可視化分析。其中，節點分別代表藥物、有效成分、皮膚傷口及靶點，邊代表節點之間的相互關系。

1.2.5 蛋白互相作用網絡的構建 將交集靶點導入String 數據庫，進行蛋白互相作用分析，以得分≥0.7 為標準篩選相互作用關系，并根據degree 值篩選出前20 個靶點作為核心靶點；將其導入Cytoscape軟件，構建蛋白相互作用網絡圖。

1.2.6 生物功能的分析 利用DAVID 數據庫對核心靶點進行GO 和KEGG 富集分析，得到興安升麻促進皮膚傷口愈合的主要作用通路；并將結果導入微生信平臺構建富集分析結果圖。

1.3 數據處理

對高分辨質譜數據進行分析，通過Proteowizard 軟件將獲得的原始數據轉換成mzXML 格式，利用XCMS 程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊。根據精確分子量（分子量誤差為≤30 ppm）、保留時間等進行物質鑒定，后續根據MS/MS 碎片模式對HMDB、METLIN、Massbank、LipidMaps、mzClound、以及帕諾米克自建標準品數據庫確認注釋獲得活性物質，并采用面積歸一化法測定各成分的相對含量。通過數據庫篩選并預測成分、疾病靶點相關信息，利用Cytoscape3.9.0 軟件、微生信平臺分析篩選結果并繪圖。SwissTargetPrediction 數據庫（http://swisstargetprediction.ch/）；SwissADME 數 據 庫（http://www.swissadme.ch/）；PubChem 數據庫（http://pubmed.cn/）；UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）；GeneCards 數 據 庫（ https://www.genecards.org/） ；OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）；DrugBank數 據 庫（https://go.drugbank.com/）；String 數 據 庫（https://www.omim.org/）；DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape3.9.0 軟件；微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/en）。

2 結果與分析

2.1 醇提物化學成分結果分析

本研究從興安升麻中共鑒定出125 種化學成分（表1），其中萜類（24.05%）、苯丙素類（23.23%）和酮類（20.61%）化合物占比較高，另外還鑒定到酚類（6.69%）、生物堿類（5.16%）、糖類（3.03%）、醌類（1.98%）、香豆素類（1.60%）和木脂素類（1.01%）等化合物。共有21 種化學成分相對含量大于1%，主要包括隱綠原酸（10.52%）、綠原酸（10.27%）、白術內脂III（8.46%）、莪術二酮（5.10%）、5-羥甲基糠醛（4.77%）、高車前素（4.73%）等，其中隱綠原酸、綠原酸為苯丙素類化合物，白術內脂III 與莪術二酮為萜類化合物；升麻屬植物主要生物活性成分為苯丙素類化合物、三萜皂苷或其苷元，以及色酮類、生物堿類、糖類、含氮化合物等[19-21]。多酚類、酮類、生物堿類等部分化合物具有顯著的抗炎功效，能夠在傷口愈合過程中發揮作用[22-23]。

表1 興安升麻醇提物化學成分Table 1 Chemical compositions of alcohol extracts from Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.

2.2 靶點篩選結果分析

對興安升麻活性成分的定性定量分析并不能確切證明其療效，也難以確定發揮治療功效的有效成分及作用機制，因此基于網絡藥理學進行靶點篩選及預測，進而分析其促愈作用機制。

2.2.1 化學成分靶點篩選及預測結果 對興安升麻的125 種化學成分進行類藥性篩選，并查閱文獻[24-25]，保留可能與“促進皮膚傷口愈合”相關性較高的化學成分，最終篩選共得到99 種有效成分，并篩選及預測到860 個目標靶點。

2.2.2 疾病靶點篩選及預測結果 以“skin wound”為關鍵詞，利用GeneCards、OMIM 和DrugBank 數據庫分別篩選出622、215 和44 個疾病靶點，經整理去重后獲得804 個相關靶點。

2.2.3 成分-疾病交集靶點篩選結果 由圖1 可知，興安升麻有效成分靶點與皮膚傷口靶點取交集后共得到159 個交集靶點，其為興安升麻促進皮膚傷口愈合的相關靶點。

圖1 “成分-疾病”靶點Veen 圖Fig.1 Veen diagram of "component-disease" targets

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖構建結果分析

對興安升麻有效成分進行編碼（表2），將藥物、成分、疾病及靶點關系導入Cytoscape3.9.0 構建網絡圖。如圖2 所示，去除相互作用較弱的游離點，圖中共有256 個節點，粉色箭頭狀節點代表興安升麻，紫色圓形節點代表95 種有效成分，綠色箭頭狀節點代表皮膚傷口，藍色圓形節點代表159 個靶點；1049條邊代表節點之間的相互關系。分析發現，興安升麻中不同的有效成分可作用于一個或多個靶點，說明興安升麻的多成分、多靶點作用于促進皮膚傷口愈合的特性。以Degree 值為判斷標準（Degree 值≥25），前20 種與靶點相關性較強的興安升麻莖葉有效成分包括：橘皮素、山姜素、5-去甲川陳皮素、高車前素、甘草查爾酮B、內華達素、甜橙黃酮、艾黃素、金腰乙素、異澤蘭黃素、異鼠李素、柳穿魚素、大黃素-甲醚、芥子酸、蔓荊子黃素、美迪紫檀素、紫膠桐酸、二氫白藜蘆醇、木蘭花堿、木香內酯，這些物質大多數為酮類化合物，還有少量的苯丙素類、生物堿類及酚類化合物。以Degree 值為判斷標準（Degree 值≥18），前20 個與興安升麻莖葉有效成分相關性較強的靶點包括：CYP19A1、EGFR、MMP13、MMP2、ABCB1、 MMP12、 PTGS2、 MMP9、 TYR、 MET、ALOX5、CYP1B1、ESR1、MMP1、TERT、KDR、SRC、MMP8、F2、AR。其中，EGFR、KDR、F2 靶點可能在此過程中發揮重要作用。

2.4 蛋白相互作用網絡構建結果分析

根據興安升麻促進皮膚傷口愈合的作用靶點，結合他們之間的蛋白相互作用，利用Cytoscape3.9.0構建交集靶點的蛋白互作網絡圖。如圖3a 所示，圖中共有150 個節點代表不同靶點，1300 條邊代表靶點間的相互關系，圖中節點由大到小、顏色由紫到黃代表節點degree 值逐漸減小。如圖3b 所示，排名前20 的PPI 核心靶點依次為：SRC、STAT3、EGFR、HRAS、TP53、AKT1、MAPK3、CTNNB1、PIK3R1、VEGFA、TNF、PIK3CA、MAPK1、JUN、IL1B、NRAS、MAPK8、RELA、MMP9、PTK2，這些靶點可能在興安升麻促進皮膚傷口愈合靶標網絡中發揮重要作用。

圖3 “成分-疾病”PPI 分析網絡圖（a）和核心靶點網絡圖（b）Fig.3 Network diagram (a) and core target network diagram (b) of the PPI analysis of ''component-disease''

2.5 GO 和KEGG 富集結果分析

如圖4 所示，對核心靶點進行GO 富集分析，選取顯著性較強的前15 條相關聯術語做可視化分析，從左到右P值逐漸增大、顯著性逐漸減弱；柱狀圖的長度越長，富集的差異基因數量越多。

圖4 核心靶點GO 富集分析圖Fig.4 GO enrichment analysis of core targets

結果表明，在生物過程方面，共有221 條相關聯術語，主要參與蛋白質磷酸化的正調控（positive regulation of protein phosphorylation）、ERBB2 信號通路（ERBB2 signaling pathway）、Fc-ε受體信號通路（Fc-epsilon receptor signaling pathway）、凋亡過程的負調控（negative regulation of apoptotic process）、表皮生長因子受體信號通路（epidermal growth factor receptor signaling pathway）等過程；在細胞組件方面，共有29 條相關聯術語，主要存在于胞漿（cytosol）、細胞核（nucleus）、粘著斑（focal adhesion）、蛋白質復合物（protein complex）、細胞膜（caveola）等組件中；在分子功能方面，共有44 條相關聯術語，主要涉及相同的蛋白質結合（identical protein binding）、激酶活性（kinase activity）、轉錄因子結合（transcription factor binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、酶結合（enzyme binding）等分子功能。

將核心靶點進行KEGG 通路富集分析，共富集到106 條相關聯通路，如圖5 所示，選取顯著性較強的前20 條通路做可視化分析，顏色由粉到藍代表P值逐漸增大、顯著性逐漸減弱；圓形圖越大，富集的差異基因個數越多。結果顯示，富集到的相關信號通路主要包括癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、乙型肝炎（Hepatitis B）、癌癥的途徑（Pathways in cancer）、ErbB 信號通路（ErbB signaling pathway）、丙型肝炎（Hepatitis C）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、催乳素信號通路（Prolactin signaling pathway）、子宮內膜癌（Endometrial cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、VEGF 信號通路（VEGF signaling pathway）、粘著斑（Focal adhesion）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）等。認為經興安升麻介導后，VEGF、EGFR 和TNF 信號通路可能通過調控相關因子和蛋白的表達，在促進皮膚傷口愈合方面發揮重要作用。

圖5 核心靶點KEGG 富集分析圖Fig.5 KEGG enrichment analysis of core targets

3 討論與結論

興安升麻在我國資源豐富，種植廣泛，作為一種藥食同源植物在河北地區深受人們喜愛。前期研究發現，興安升麻能夠有效促進皮膚傷口愈合[14]。皮膚創傷修復是一項復雜而精密的動態過程，利用信號網絡進行精準的執行和調控；而網絡藥理學是一個基于信息檢索、數據分析及網絡構建的領域。因此本研究基于網絡藥理學進一步分析了興安升麻對皮膚傷口的促愈機制，發現興安升麻的多成分、多靶點作用于促進皮膚傷口愈合的特性；其中橘皮素、山姜素、5-去甲川陳皮素等成分可能在促進皮膚傷口愈合過程中發揮重要作用。已有研究證實以橘皮素為主要多酚物質的小花山奈具有抗氧化和抗炎活性，能夠抗皮膚炎癥[26]；山姜素能夠有效減輕潰瘍性結腸炎小鼠腸道炎癥，并改善小鼠腸上皮屏障功能[27]；5-去甲川陳皮素也具有抗炎活性，能夠抑制小鼠耳部炎癥的形成及損傷[28]。“藥物-成分-疾病-靶點”分析發現EGFR、KDR、F2 靶點也在此過程中發揮重要作用。EGFR 基因提供了制造表皮生長因子受體的受體蛋白的指令，能夠促進細胞的生長繁殖[29]；KDR 基因所編碼的蛋白VEGFR-2，是血管生長因子重要信號轉導的重要受體，具有調控血管內皮細胞增生、趨化內皮細胞和增加血管通透性等功能[30]；F2 基因提供了制造凝血酶原的蛋白質的指令，對細胞生長和分裂、組織修復和新血管形成、血液凝固具有重要作用[31]。通過靶點與疾病的相關分析，認為VEGF、EGFR 和TNF 信號通路可能通過調控相關因子和蛋白的表達，在促進皮膚傷口愈合方面發揮重要作用。VEGF信號通路是調控心血管生成的重要信號通路，調控與新血管生成相關的下游基因，促進血管內皮細胞的增殖、遷移、存活，控制心血管的生成，促進皮膚傷口愈合[32-33]。EGFR 信號通路可以促進表皮細胞、成纖維細胞的增殖和其他生長因子的合成，進而加速皮膚傷口表皮的愈合與再生[34-35]。TNF 信號通路通過調控炎癥因子和相關蛋白的表達，進而實現傷口清創及愈合[36]。

本研究通過HPLC-MS 檢測興安升麻醇提物的化學成分，從中共鑒定出125 種化學成分，其中包括大量萜類、苯丙素類、酮類、酚類化合物，以及生物堿類、糖類、醌類、香豆素類和木脂素類等化合物，且隱綠原酸、綠原酸、白術內脂III 為含量最高的三種活性成分。進一步基于網絡藥理學預測其促愈保護作用，結果表明興安升麻中的活性成分可作用于一個或多個靶點，EGFR、KDR、F2 等重要靶點及橘皮素、山姜素、5-去甲川陳皮素等活性成分可能在此過程中發揮重要作用，說明興安升麻多成分、多靶點作用于促進皮膚傷口愈合的特性；經興安升麻介導后，VEGF、EGFR 和TNF 信號通路可能通過調控相關因子和蛋白的表達，發揮對皮膚傷口的促愈作用。本研究結果明確了興安升麻的活性成分，并基于網絡藥理學分析了其對皮膚傷口的促愈作用機制，為后續對興安升麻的開發與應用提供理論支撐。