外泌體miRNA在狼瘡性腎炎中的作用研究進展

徐璐瑤,林栩

(1.右江民族醫學院臨床醫學院,廣西百色 533000;2.右江民族醫學院附屬醫院腎內科,廣西百色 533000)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種主要影響女性的自身免疫性疾病,其特征在于不同器官/組織中存在自身抗體、免疫復合物(ICs)和補體沉積以及相關的自身免疫性炎癥,其中對自身抗原耐受性喪失導致致病性自身抗體的產生,從而導致炎癥和組織損傷[1]。狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是SLE的常見并發癥,LN導致腎功能逐漸下降和腎衰竭,并且是SLE患者死亡的主要原因[2]。LN涉及多種發病機制,現有研究表明,SLE的腎外病因學是基于多種組合的遺傳變異體,這些變異體損害了對核自身抗原免疫耐受的機制。因為抗核抗體的存在,這種耐受性的缺失在臨床上變得可檢測,這也解釋了臨床表現的巨大差異性。此外,當中性粒細胞死亡時,它們通常釋放中性粒細胞外網,這些外網由染色質纖維、組蛋白和中性粒細胞抗菌及免疫刺激蛋白組成。這種類型的細胞死亡,稱為網狀細胞死亡,通常是一種宿主防御機制,以捕獲和殺死微生物。在SLE患者的腎臟中也發現網狀中性粒細胞促進炎癥,可能導致內皮損傷,并能誘導漿細胞樣樹突狀細胞產生干擾素(IFN)-α[3]。從凋亡的中性粒細胞釋放的核酸通過病毒核酸特異性Toll樣受體激活先天性和適應性免疫。因此,樹突狀細胞、輔助性T細胞、B細胞和漿細胞都對異常的多克隆自身免疫有作用。LN的腎內病因包括抗體與多種腎內自身抗原的結合,隨著腎臟免疫病理學的進展,三級淋巴組織形成和局部抗體產生增加了腎內補體激活[4]。然而,迄今為止,對于LN的治療仍以糖皮質激素和免疫抑制劑治療為主,但藥物減量或停藥后易復發,且病情逐漸加重。因此,尋求一種新的治療策略尤為重要。

外泌體是由細胞分泌的直徑為30～100 nm的盤狀囊泡,含有大量的脂質、DNA、microRNA、蛋白質及代謝物等腔內內容物,這些內容物被細胞釋放到細胞外,并與其他細胞上的受體結合,誘導細胞內信號傳導和受體細胞生理狀態的改變,在細胞穩態和細胞間通信中起著重要的作用[5]。已有相關證據表明外泌體參與了腎臟生理和各種腎臟疾病的致病機制,廣泛研究包括LN、狼瘡腎小球疾病、急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)、糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD),以及腎纖維化和慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)的進展過程[6]。這些研究進一步表明,外泌體具有豐富的信息或分子,為涉及外泌體攜帶的這些分子異常的特定疾病中的生物標志物的發現提供了優勢,因此,外泌體潛在的臨床應用可能是外泌體作為生物標志物和潛在的治療工具。

1 外泌體及miRNA

外泌體起源于被稱為MVBs的內部多泡腔室,是一種小的膜囊泡,由大多數細胞類型的多囊泡核內體分泌,囊泡內含有大量的蛋白質、脂質甚至核酸,這些分子通過胞吐作用被釋放到細胞外,誘導細胞內信號傳導和受體細胞生理狀態的修飾[7]。外泌體在細胞間起通信作用并影響靶細胞的生物學效應的機制主要有三個方面：一是外泌體可以攜帶配體與不同的細胞表面受體結合;二是外泌體可以與靶細胞膜結合,然后靶細胞膜將攜帶“新的”表面分子;三是外泌體可以與靶細胞融合,從而在兩種細胞類型之間交換膜蛋白和細胞質。外泌體的產生將增加攜帶相關肽-MHC復合物的樹突狀細胞的數量,從而放大免疫反應,在沒有炎癥的情況下,攜帶外泌體的樹突狀細胞的自發遷移可能有助于耐受性的誘導[8]。這種擴散的結果既取決于捕獲外泌體的樹突狀細胞的狀態(特別是來自非應激或未感染的未成熟樹突狀細胞或腫瘤的外泌體),也取決于外泌體所攜帶的分子(如來自成熟/感染/應激細胞的促炎信號或來自一些非應激腫瘤的免疫抑制信號)[9]。

microRNA(miRNA)是一種長為21～22個核苷酸的小分子、非編碼RNA,通過與mRNA的相互作用在調節各種生物過程中發揮重要作用,已被證明參與細胞生長、組織分化、細胞增殖和細胞凋亡等過程[10]。miRNA可以被運輸到外泌體或微囊泡中,并分泌到細胞外,包括各種生物液體,因此可以進行長程細胞間通訊[11]。miRNA微陣列分析顯示,在來自SLE患者的血漿樣品中檢測到113個上調和94個下調的miRNA,新的證據表明[12],miRNA參與了SLE的病理生理過程,在血漿或血清中檢測到的腫瘤來源的miRNA可以作為檢測常見人類癌癥類型以及其他已知疾病和綜合征的診斷及預后的循環生物標志物。它將可能為基于細胞外miRNA的生物標志物的發現和治療模式開辟一個新的領域。

2 外泌體miRNA在LN免疫調控中的機制

LN是腎小球免疫復合物沉積和隨之而來的慢性炎癥反應的結果[13]。有研究報道已在SLE患者中檢測到含免疫復合物的外泌體[14]。作為新的信息穿梭媒介,外泌體介導局部自分泌或旁分泌信號到附近的細胞,以及遠距離內分泌信號到遠處的細胞。在LN中,外泌體可能通過運載自身抗原或補體、促進免疫復合物沉積或補體激活、刺激炎癥反應,進一步引起腎組織損傷或微血栓形成而產生致病作用[1]。研究表明,外泌體增強了單核細胞和T細胞遷移、單核細胞活化和巨噬細胞吞噬活性,并且促進單核細胞對促炎細胞因子IL-8的產生,而這可以通過靶向波形蛋白(si-波形蛋白)的小干擾RNA恢復到其基礎水平[15]。我們觀察到活動期LN患者的非經典單核細胞計數低于無腎臟受累的患者,所有單核細胞亞群在LN患者中人CX3C趨化因子受體1(CX3CR1)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達均低于無LN患者,高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)水平升高[16]。單核細胞和巨噬細胞可以通過Toll 樣受體 4(TLR4)受體識別HMGB1,從而產生促炎細胞因子[17]。這些發現為巨噬細胞通過外泌體途徑參與腎臟病理中的免疫應答提供了重要意義。

miRNA通過結合3’或5’非翻譯區(UTR)來破壞和阻斷編碼蛋白的翻譯,從而對mRNA序列進行轉錄后調節,可能是維持免疫耐受和自身免疫平衡的因素之一[18]。研究發現,在miR-155缺陷小鼠中,活化CD4+、CD25+(Foxp3-)細胞的頻率降低,CD4+T細胞表現出不太明顯的Th2和Th17以及略微降低的Th1反應趨勢。Pristane誘導的野生型顯示與INF特征相關基因(MX1、IP10、IRF7、ISG15)的表達顯著上調,T效應細胞/Treg細胞的比率增加,絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和TLR通路的激活減少,并且IL-6和TNF水平降低[19]。將miR-155模擬物轉染到人腎系膜細胞(HRMCs)中,miR-155可以通過下調CXCR5-ERK信號通路在趨化因子CXC配體13(CXCL13)刺激下的表達來減少HRMCs的增殖和p-ERK及轉化生長因子β1(TGF-β1)的產生,因此,這表明miR-155可以通過下調CXCR5-ERK信號通路來抑制CXCL13誘導的LN中HRMCs的增殖[20]。

MOMEN-HERAVI等人[21]成功將外源性miRNA-155 mimic和miRNA-155抑制劑引入小鼠B細胞來源的外泌體,并表明負載外泌體可以將miRNA-155模擬物和miRNA-155抑制劑分別傳遞給原代小鼠肝細胞及RAW 264.7巨噬細胞。B細胞來源的外泌體能有效地將miRNA-155抑制劑傳遞到RAW 264.7細胞中,抑制miRNA-155,并在功能上導致TNF-α蛋白水平有統計學意義的下降。據報道,外泌體miRNA-155直接靶向細胞因子信號傳導抑制蛋白1(SOCS1),其表達與miRNA-155水平呈負相關[22]。將miRNA-155抑制劑成功傳遞到RAW 264.7細胞后,SOCS1的mRNA水平升高。實驗顯示,與miRNA-155負載外泌體共培養的原代小鼠肝細胞中,miRNA-155的水平增加了700倍以上[21]。該研究結果有效證明了B細胞來源的外泌體可以作為基于RNA的治療策略的有效載體,并為使用外泌體作為具有最小細胞毒性的高效傳遞納米載體提供了新的理論依據。

3 外泌體miRNA可以作為LN早期診斷的潛在生物標志物

LN的特征是自身抗體誘導的腎損害,在臨床實踐中,由于缺乏高特異性和敏感性的理想生物標志物,使得LN的診斷是復雜和具有挑戰性的。miRNA對于調節腎臟的發育、功能和穩態是不可或缺的,并且它們很容易在許多生物液體中被檢測到,因此,越來越多的研究致力于探索這些分子作為LN的理想生物標志物。對血漿中miRNA表達與LN腎功能不全患者疾病活動性之間關系的分析顯示,活動期SLE腎功能不全患者4種miRNA(miR-15b、miR-93、miR-25和miR-19b)的表達均顯著低于穩定期患者。miR-15b和miR-22在低eGFR [eGFR<60 mL/(min·1.73 m2)]的SLE患者中顯著降低,優于腎功能較好者[eGFR>60 mL/(min·1.73 m2) ](P分別為 0.01和0.012)。基于上述分析,miR-15b可以作為合并低eGFR的LN患者的潛在疾病生物標志物[23]。LI等人[24]研究了從LN患者的尿液外泌體中分離的miRNA的表達變化,觀察發現伴有新月體形成的LN具有獨特的尿外泌體miRNA表達譜和復雜的調控網絡,并發現尿外泌體中的miR-3135b、miR-654-5p和miR-146a-5p可用作伴有新月體的LN的新的非侵入性診斷標志物。LIU等人[25]還發現PA-S14通過激活LKB1/AMPK信號通路,抑制腎小管細胞衰老,延緩纖維生成。轉錄組學測序和突變分析進一步證明PA-S14是通過LKB1/AMPK介導的自噬和線粒體穩態途徑治療腎纖維化的一種潛力。研究顯示,在自身免疫性腎小球腎炎患者的尿液外泌體中發現miR-26a水平升高,并與尿蛋白水平呈正相關,這與足細胞損傷密切相關,外泌體中改變的miR-26a水平可以作為這些患者足細胞損傷的生物標志物[26]。

4 外泌體miRNA在LN診斷、治療及預后靶點中的作用

相關研究表明,miR-21通過靶向與自身免疫性疾病的發展相關的幾種炎性分子如IL-12、TNF和IFN-γ來介導抗炎作用[27]。SOLé等人[28]觀察了miR-21、miR-150和miR-29c對早期評價LN腎纖維化的預后價值,證明了由miR-21、miR-29c和miR-150組合通過SP1和Smad3/TGFβ途徑增加促纖維化分子,miR-29c/miR-150/miR-21表達水平的多標記組合顯示出最高的敏感性和特異性(分別為94.4%和99.8%,AUC=0.996)。研究結果還進一步顯示miR-29c/miR-150/miR-21組合的存在是進展為ESRD的預測因子,其預測價值優于常規生物標志物,如肌酐和eGFR。這個生物標志物組合可以用作腎纖維化的診斷標志物和進展為ESRD的預后生物標志物,為檢測早期腎纖維化提供了有效策略。外泌體miRNA和特定信號轉導途徑之間的聯系意味著免疫抑制治療可以針對特定的miRNA譜進行調整。TANG等[29]發現在MPA治療后,LN患者CD4+T細胞中miR-142-3p/5p和miR-146a的表達均顯著增加,與未處理的細胞相比,經MPA處理的SLE患者的CD4+T細胞在假定的miRNA-142調控區域顯示H4乙酰化水平富集,而在假定的miRNA-146a調控區域顯示H3乙酰化水平提升,MPA通過啟動子區域的組蛋白修飾激活miR-142和miR-146a的表達,這可能部分解釋了MPA治療SLE的藥理機制。這些研究表明外泌體miRNA在腎臟恢復中可能起作用,可能有助于在LN中作為新的治療靶點并指導預后評估。

5 通過外泌體miRNA靶向藥物遞送系統治療LN的可能性

外泌體體積小,能有效避免單核巨噬細胞的吞噬,自由穿越血管壁和細胞外基質,可以避免調理素和凝血因子的激活。受體介導的內吞作用是外泌體與靶組織之間信息交流的主要方式之一,它優化了外泌體的內吞過程,促進了被包裹藥物的內化,有利于內容物在血液中以高轉運效率持續穩定地轉運[30]。此外,外泌體具有很強穿透生物屏障(如血腦屏障)的能力,因此它們具有天然藥物遞送的優勢,是很有前途的靶向藥物載體。HANEY等[31]發現在PD的體內和體外模型中,外泌體運載的過氧化氫酶(CAT)可以有效地降低氧化應激并增加神經元的存活率。同時,將CAT負載于外泌體上,可以保持其生物活性,降低免疫原性,延長血液循環時間,解決其易失活、快速降解的不足,從而增強治療效果。已有研究證明,選擇經典活化的M1型巨噬細胞衍生的外泌體作為載體,M1-Exos通過caspase-3介導的途徑提供了增強抗腫瘤活性的促炎環境,能降低PTX的毒性,提高其生物利用度。PTX不僅被成功地遞送到小鼠的腫瘤組織,而且通過激活NF-κB通路,它建立了促炎環境以增強PTX的治療效果[32]。上述研究揭示了外泌體作為藥物載體遞送的治療劑之一,可在癌癥、炎癥等多種病理過程中發揮作用,將作為治療LN的潛在治療工具。

6 展望

當前研究結果表明,外泌體miRNA可以作為新的生物標志物和潛在的治療工具,在LN和SLE的診斷、治療及預后評估的過程中發揮重要作用。此外,因外泌體miRNA來源于體內,具有更好的生物相容性和更低的免疫原性、小細胞毒性及易跨膜轉運等優勢,其作為藥物載體應用于臨床治療具有廣闊的前景。然而,關于LN中miRNA的研究大多集中在血清和外周血單個核細胞,對外泌體miRNA的研究仍處于初步探索階段,因此,未來的研究仍將致力于外泌體miRNA在自身免疫疾病中涉及的具體作用機制及相關信號通路,這將為LN的治療模式開創新的可能性的領域。