肝癌干細胞和腫瘤微環境的研究進展

張定,孫悅,盧圻 ,吳雪銘

(1．右江民族醫學院附屬醫院病理科,廣西百色 533000;2．右江民族醫學院研究生學院,廣西百色 533000)

肝癌是世界上第六大常見惡性腫瘤,也是癌癥相關死亡的第三大原因,2020年全球新增病例約906 000例,死亡83萬例。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發性肝癌中最常見的一種類型,占所有肝癌病例的75%～85%[1]。由于HCC缺乏早期篩查手段,大多數HCC病例確診時已是晚期,同時因為肝癌高復發率及耐藥等問題,即使患者接受正規治療,整體預后依舊很差。腫瘤微環境(tumor microenvironment,TME)是腫瘤細胞生存的細胞環境,由多種細胞成分和非細胞成分構成,與腫瘤細胞的生長、增殖、免疫逃逸和耐藥有關。腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤中的一個小亞群,具有自我更新和無限增殖的特點。既往研究表明CSCs具有高度的致瘤性、轉移性、耐藥性,與腫瘤復發密切相關,而這些與肝癌TME對肝癌干細胞(liver cancer stem cells,LCSCs)的特殊調節方式密不可分。近年隨著研究技術的進步,研究人員又發現了一些新的分子機制。因HCC是肝癌中最常見的類型,故本文將以HCC為代表總結近年來肝癌TME對LCSCs作用的研究進展,以期為肝癌治療提供新思路。

1 肝癌干細胞

CSCs首次在急性髓系白血病中發現,隨后在實體性腫瘤如肺癌、乳腺癌、結直腸癌、宮頸癌、肝癌等中均證實了其存在。2006年美國癌癥研究協會(AACR)明確提出了CSCs的定義,認為CSCs是腫瘤組織內一群具有自我更新能力并能影響腫瘤細胞形成多種異質譜系的細胞群,其具有高度的致瘤性和侵襲性,能夠驅動腫瘤的生長、轉移和復發[2]。雖然距CSCs定義的提出已有十余年,但CSCs的鑒定與篩選至今仍是一大難題。目前篩選CSCs的方法主要利用CSCs表面的特殊標志物,應用熒光活化細胞或磁性活化細胞分選技術進行篩選,但這些方法自身都存在著一定局限性。對于LCSCs而言,目前比較成熟的標志物有EpCAM、CD133、CD90、CD44、CD24、CD13以及OV6等[3]。此外,關于LCSCs的起源目前也存在著多種看法,有學者認為LCSCs可能由成熟的肝細胞/膽管細胞通過突變及去分化過程轉化而來[4],也有學者認為LCSCs是正常肝干細胞成熟受阻后異常分化的結果[5],但近年有研究表明肝細胞譜系內任何階段的細胞都具有成為LCSCs的潛力[6]。據此筆者猜測,LCSCs可能與其他CSCs類似[7],可來源于多種非CSCs,其本身處于CSCs和非CSCs之間相互轉化的動態平衡過程中。

2 腫瘤微環境與肝癌干細胞

近年研究表明TME的內在成分可通過多種分子信號通路協助腫瘤細胞獲得CSC特性,提示TME對CSC的形成有著不可或缺的作用。TME是腫瘤細胞生存的直接環境,由細胞成分(如成纖維細胞、免疫細胞亞群、血管內皮細胞)和非細胞成分(如細胞外基質、細胞因子、生長因子及激素)構成,具有低氧、低pH等特點。TME和腫瘤細胞之間存在著復雜的相互作用。一方面,適宜的微環境促進了腫瘤的生長、增殖、免疫逃逸以及耐藥等行為的發生;另一方面,腫瘤細胞可通過分泌多種細胞因子,促進成纖維細胞的募集、免疫細胞的遷移、基質的重塑以及血管網絡的形成,構成適合其生存的微環境。在TME中,CSCs生態位是CSCs生存的一種特殊的微環境,其通過細胞-細胞接觸和分泌因子的形式來調控CSCs[8]。目前,多項研究表明肝癌TME不同成分在促進LCSCs表型轉變及維持其干性等方面發揮著重要作用。

2.1 腫瘤相關成纖維細胞和肝癌干細胞腫瘤相關成纖維細胞(tumor-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤間質中重要的組成成分,其分泌的生長因子、炎癥介質以及胞外基質蛋白對腫瘤的進展起著重要作用。αSMA在很多腫瘤中被認為是CAFs的細胞分子標志物,而活化的肝星狀細胞可增加αSMA的表達[9],據此有學者推測肝星狀細胞可能是CAFs的來源之一,但目前尚缺乏譜系追蹤分析的證據支持。隨著對CAFs研究的不斷深入,人們發現肝癌中CAFs在LCSCs的轉化、自我更新等方面存在著一定影響。LI等人[10]的實驗證實了CAFs可通過旁分泌的形式分泌肝細胞生長因子和IL-6,這兩種細胞因子將激活CD24+HCC細胞內STAT3磷酸化,從而增強其干性。相繼地,LOH等人[11]的實驗證明肝癌中CAFs分泌的FSTL1可促進肝癌細胞形成干細胞樣特性。除了通過分泌細胞因子的方式影響LCSCs外,CAFs還可通過這種細胞-細胞直接接觸的方式,促進LCSCs中組蛋白去甲基化酶(LSD1)脫乙酰化,進而激活Notch信號通路依賴的自我更新,促進腫瘤的生長[12]。

2.2 腫瘤相關巨噬細胞和腫瘤干細胞腫瘤組織中的腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)存在兩種來源,一是長期定居在組織周圍的巨噬細胞,二是因局部炎癥刺激從血管壁中游出的單核-巨噬細胞。在TME中,這些TAMs常處于一種激活的狀態,其比例在不同類型腫瘤中也不盡相同。TAMs和LCSCs之間的作用是復雜且相互的。LCSCs產生的一些細胞因子可促進巨噬細胞的遷移與募集[13]。而TAMs也通過分泌一些信號分子作用于LCSCs,最終促進HCC細胞形成CSC特性,如miR-27a-3p、TNF、TGFβ1[14-16]。但TAMs除了經典的促腫瘤作用外,在特定條件下也可表現出抗腫瘤的作用。CHAO等人[17]研究發現阻斷HCC中CD47與SIRPα的聯系可促使腫瘤組織中的巨噬細胞吞噬腫瘤細胞。因此,通過抗體阻斷CD47-SIRPα信號有希望成為靶向針對LCSCs的一種方法。

2.3 腫瘤浸潤淋巴細胞和肝癌干細胞腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infifiltrating lymphocytes,TILs)是一類從血液中游出然后進入腫瘤組織內的特殊淋巴細胞群,是構成腫瘤微環境的重要細胞組成。其主要由T細胞、B細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)、巨噬細胞(macrophage,Mφ)和髓系來源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)等組成,以T細胞成分為主。其中,T細胞包括輔助性T細胞(T helper,Th)、細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells,CTLs)和調節性T細胞(T-regulatory cells,Tregs)。近年的研究表明TILs與多種CSCs密切相關。膠質母細胞瘤干細胞可分泌腱糖蛋白-C(tenascin-C)抑制T細胞的活性[18]。SOX2過表達的乳腺癌干細胞可通過NF-κB-CCL信號通路募集Treg細胞,從而促進腫瘤的生長、轉移與耐藥[19]。而在肝癌中,LCSCs對TILs也存在著一定影響,在缺氧的條件下,LCSCs可分泌趨化因子CCL28促進肝癌TME招募Treg細胞[20]。此外有研究發現LCSCs也可表達調節因子SOX2,促進PD-L1轉錄[21],間接影響TILs發揮抗腫瘤作用。

2.4 腫瘤血管和肝癌干細胞腫瘤的生長、維持、進展離不開腫瘤血管的生成。目前已發現的腫瘤血管生成方式包括以下4種：出芽式再生、套疊式再生、血管擬態生成、血管內皮祖細胞募集和血管新生。此外,目前研究已表明CSCs在一定條件下可轉化成血管內皮細胞或血管平滑肌樣細胞[22-24],從而促進腫瘤血管生成。YANG等人[25]選擇3組HCC患者的肝切除標本,檢測14個與肝癌干/祖細胞(HSC/HPC)或腫瘤血管生成相關的標志物,發現肝癌干/祖細胞生物標志物高表達與HCC血管生成以及不良預后有關。間接說明LCSCs與腫瘤血管生成之間可能存在某些相互作用,這些相互作用對患者的預后具有不良影響。盡管目前關于腫瘤血管生成和LCSCs之間的研究少之又少,但肝癌作為一種高度血管化的腫瘤,腫瘤血管生成與其之間應存在某些聯系,未來需要人們進行更進一步的探索。

2.5 細胞外基質硬度和肝癌干細胞細胞外基質(extracellular matrix,ECM)是由蛋白質與糖類等生物大分子構成的復雜三維非細胞的網絡結構,可為腫瘤提供結構上的支持并促進癌細胞的一系列生物學行為。基質硬度作為ECM的重要物理屬性,與HCC的發展密切相關。臨床資料表明,肝硬度增加是HCC進展的重要危險因素,超過80%的HCC患者都具有肝硬化或肝纖維化的背景。腫瘤細胞和CAFs可分泌基質蛋白,并促進這些基質蛋白聚集、收縮、交聯,從而使HCC基質硬度增加。增硬后的基質將觸發機械-化學信號轉導,將胞外機械信號(如基質硬度)轉為胞內化學信號,通過特定轉錄因子(如YAP/TAZ、NF-κB等)來促使癌癥的進展[26],但ECM硬度與LCSCs的關系目前尚不明確,TIAN等人[27]的研究小組通過使用可調節聚丙烯酰胺(PA)水凝膠模擬不同階段肝組織ECM的硬度來探究其對LCSCs的影響,結果表明在軟基質處理后HCC細胞群表達更多的CSCs標記,并且自身具有更強的克隆增殖能力。但LI 等人[28]的研究表明,ECM硬度的增加將引起HCC細胞群中干細胞標志物表達比例升高,而這也許和YAP激活的下游信號通路有關。

2.6 低氧和肝癌干細胞由于肝癌生長迅速,肝癌TME常呈缺氧的狀態,缺氧誘導因子-1(HIF-1)是使肝癌細胞在缺氧中存活的關鍵轉錄因子,由穩定的HIF-1β亞基和氧敏感亞基HIF-1α組成。低氧會引起脯氨酰羥化酶失活,導致細胞內羥基化過程減少,進而引起HIF-1α水解減少,使其在細胞核中積累,積累的HIF-1α與HIF-1β二聚化后可激活多種靶基因的轉錄,從而促進腫瘤血管生成、異常葡萄糖代謝、癌細胞增殖與侵襲等過程的發生。與此同時,多項研究表明HIF-1還可以通過引發一系列代謝反應促進HCC耐藥[29]。一直以來,缺氧與癌細胞干性的形成密切相關,近期的一些研究則更進一步證明了這一事實。XIAO等人[30]的研究表明缺氧將引起肝癌細胞中雄激素受體(AR)的低表達,進而可能通過AR/miR-520f-3p/SOX9信號通路促進肝癌細胞形成干細胞特性。CUI等人[31]證實了在缺氧條件下HCC的干性依賴于HIF-1α的調控,HIF-1α可直接調控SENP1的轉錄,與此同時,缺氧條件下的SENP1通過去SUMO化過程穩定HIF-1α亞基的轉錄活性,二者之間存在正反饋。通過這種正反饋,放大了SENP1促HCC干性基因表達的作用,體外實驗和異種移植模型試驗證明,特異性下調SENP1將顯著抑制由缺氧導致的相關癌細胞干性的形成。LING等人[32]發現,敲低泛素特異性蛋白酶22(USP22)基因可抑制CSC干性相關基因的表達。而在缺氧條件下,HIF-1α可促進USP22的轉錄,另一方面,USP22又可通過去泛素化穩定HIF-1α。二者通過正反饋回路促進了缺氧誘導的HCC干性形成。

3 治療

傳統的肝癌藥物治療主要針對腫瘤組織內快速增殖的腫瘤細胞,并未重視LCSCs這一細胞亞群,為腫瘤的復發與轉移留下了隱患。要想根除腫瘤就必須根除腫瘤內的CSCs細胞亞群,而CSCs受TME調控,所以針對CSCs的治療可從TME入手,目前部分針對肝癌TME的靶向藥物已經進入臨床,如抗PD-1/PD-L1以及抗VEGFR治療,其他類型藥物(如靶點為微環境內的CAFs或TAMs)也在體內、體外實驗中獲得成功。雖然目前直接針對LCSCs的藥物尚未投入臨床使用,但已有不少體外實驗證明這些藥物是安全且有效的。針對LCSCs的治療靶點可分為針對其表面標記分子和特定的調節信號通路兩大類。NGR是一種能與CD13特異性結合的多肽,NGR-LDP-AE是一種靶向CD13細胞的合成蛋白,由NGR肽和腫瘤抗生素力達霉素組成,對LCSCs和血管生成內皮細胞均有效,該藥物有可能成為一種針對肝癌的雙靶向治療藥物[33]。TONG等人[34]發現,ANXA3/JNK信號通路可以促進HCC的增殖以及LCSCs的自我更新和生長,通過單克隆抗體中和ANXA3不僅可以抑制HCC的增殖,同時可以清除CD133+的LCSCs亞群。但這些直接針對LCSCs的藥物都面臨著一個難題：正常肝干細胞和LCSCs具有許多相同的分子標記和信號通路,在治療LCSCs的過程中難免會影響到正常肝干細胞,從而可能抑制正常的肝再生導致肝功能衰竭,這是未來研究所必須解決的一個難題。

4 小結

TME不僅為腫瘤細胞提供了合適的生存環境,其內在組分也在不同方面影響著腫瘤細胞,其中就包括CSCs這一重要亞群。既往的治療方式往往只針對腫瘤組織內的腫瘤細胞,卻忽視了CSCs,結果必將影響腫瘤治療的療效。近年隨著TME和CSCs成為腫瘤領域的兩個熱點話題,大量相關的研究也接踵而至。現有的研究結果已證明二者均可促進肝癌的發生與進展,且肝癌TME可通過多種途徑參與對LCSCs的調節,在促進LCSCs轉化及維持LCSCs干性表型等方面發揮著重要作用。這些發現推動了針對肝癌TME和LCSC的靶向治療藥物的研發。目前部分針對TME的藥物(如抗PD-1/抗PD-L1)已投入臨床使用,而針對LCSC的藥物也在如期地進行臨床試驗。雖然在LCSCs領域仍有許多難題,但筆者相信隨著研究的不斷深入,這些難題終將得到解決。這將在幫助人類理解TME與CSC二者之間的作用的同時,為肝癌的治療提供新的思路,對改善絕大多數肝癌患者的不良預后有著不可或缺的作用。