基于廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)的不同花色秋石斛中花青素差異分析

武美卿，廖 易，陸順教，殷涵泰，余文剛，李崇暉*

基于廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)的不同花色秋石斛中花青素差異分析

武美卿1,2，廖 易2,3，陸順教2,3，殷涵泰1,2，余文剛1*，李崇暉2,3*

1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南海口 570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶作物資源遺傳改良與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571101；3. 海南省熱帶觀賞植物種質(zhì)創(chuàng)新利用工程技術(shù)研究中心，海南儋州 571737

為了深入研究不同花色秋石斛品種花青素合成途徑的差異性，本研究利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)藍(lán)紫色、淺桃紅色、紅色、紫紅色和深紫紅色5個(gè)不同花色秋石斛品種的花青素苷組成和含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：從供試秋石斛中共鑒定出38個(gè)代謝產(chǎn)物，主要為矢車菊素（Cy）、芍藥花素（Pn）、天竺葵素（Pg）、飛燕草素（Dp）和矮牽牛素（Pt）的糖苷及其酰基化衍生物。5個(gè)秋石斛品種中花青素苷組成和含量存在顯著差異。代謝物差異分析表明，紫紅色花中Cy和Dp型糖苷顯著高于淺桃紅色花（<0.05）；藍(lán)紫色花的差異花青素中3種Dp型糖苷含量均顯著高于其他顏色；僅篩選出1種Cy型糖苷在淺桃紅色花中富集。絕大多數(shù)樣品的Cy型糖苷含量最高，隨著Cy和Dp及其衍生物含量增加，花色會(huì)加深并轉(zhuǎn)向紅紫色，推測(cè)Cy型糖苷使秋石斛偏向紫紅色，而Dp糖苷賦予秋石斛藍(lán)紫色調(diào)。基于以上結(jié)果推測(cè)秋石斛存在上述5種花青素苷的酰基化修飾途徑，研究結(jié)果可為秋石斛花色形成機(jī)制和花色改良提供依據(jù)。

秋石斛；花色；代謝組；花青素

花色是觀賞植物極為重要的觀賞性狀之一。植物花色的呈現(xiàn)受花色素種類和含量、色素在花部組織中的分布、液泡pH、輔助色素、金屬離子絡(luò)合、表皮細(xì)胞形狀等的影響，其中色素的種類和含量是首要因素[1]。花青素苷（anthocyanin）賦予觀賞植物從粉紅、紅、紫紅到藍(lán)顏色變化，其基本結(jié)構(gòu)是2-苯基苯并吡喃的糖基化多羥基或聚甲氧基衍生物。常見的花青素苷為以天竺葵素（pelargonidin, Pg）、矢車菊素（cyanidin, Cy）、飛燕草素（delphinidin, Dp）、芍藥花素（peonidin, Pn）、矮牽牛素（petunidin, Pt）和錦葵素（malvidin, Mv）6種花青素苷元糖苷化修飾后產(chǎn)生，進(jìn)而可以發(fā)生酰基化修飾[2]。Pg類色素為橙紅色調(diào)，Cy類色素為深紅色調(diào)和Dp類色素為藍(lán)色調(diào)提供了基礎(chǔ)[3]。研究花色素組成和含量是解析花色形成和變異機(jī)理，定向改良花色的前提。

石斛蘭為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（）植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，擁有大量原生種和人工雜交種，極具觀賞價(jià)值[4]。秋石斛是以蝴蝶石斛（Fitzg.）為主要親本雜交而成的蝴蝶石斛系（- type）[5]。因其花形俏麗、花色鮮艷和瓶插期長等優(yōu)良特性，成為熱帶蘭中極為重要的盆花和切花產(chǎn)品[6]。商品化秋石斛花色單一，以紫紅色系為主，缺少亮橙、火紅、天藍(lán)等花色[5, 7]。其色素組成主要有兩大類：花青素苷使花色呈現(xiàn)紫紅、藍(lán)紫、粉紅等顏色[7-8]；類胡蘿卜素使花色呈黃綠色、金黃色等[9]；二者共同作用產(chǎn)生棕色[5, 7]。長期以來，對(duì)秋石斛花青素苷組成了解極少，僅從其花中分離并鑒定到4種Cy型酰基化的花青素苷[10-12]，在苷元水平，秋石斛的近緣種和部分雜交種中僅檢測(cè)到Cy、Pn和Pg共3種類型的花青素，且以Cy為絕對(duì)主要色素，Pn含量很低，而Pg僅存在于極少數(shù)桃紅色種質(zhì)中[7]。課題組前期利用HPLC-MS技術(shù)推定了幾種秋石斛的花青素苷均為Cy型酰基化糖苷[8]，近年研究人員利用UPLC- QTOF-MS從紫紅色的三亞陽光品種中鑒定出Cy、Pn、Dp、Pt、Mv的8種3-糖苷[13]。然而，目前不同花色秋石斛中花青素苷的組成和含量差異仍缺乏系統(tǒng)認(rèn)知。

代謝組學(xué)技術(shù)在植物及其次生代謝物研究領(lǐng)域中具有舉足輕重的作用。對(duì)植物代謝組的研究包括代謝物積累模式、代謝物積累的遺傳基礎(chǔ)、功能基因鑒定、代謝途徑解析及自然變異的遺傳分析等方面的研究[14]。利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)植物體內(nèi)的次生代謝物進(jìn)行定性定量，同時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)植物整體進(jìn)行相關(guān)分析，從生物樣本中檢測(cè)并篩選出具有重要生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的代謝物，從而揭示和闡明植物次生代謝物的合成途徑和代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制[15]。通過代謝組技術(shù)可以鑒定觀賞植物中的差異代謝物，解析花色差異形成的機(jī)理。如Mv型糖苷使鴛鴦茉莉花瓣呈藍(lán)紫色[16]，也是紫色鹿角杜鵑花瓣的關(guān)鍵花青苷[17]。Pn型糖苷是紅色系長春花的呈色物質(zhì)，Dp型糖苷的增加促使紅紫色系長春花花色向紫色轉(zhuǎn)變[18]。

本研究通過花青素苷廣泛靶向代謝組學(xué)研究4個(gè)色系5個(gè)秋石斛品種的差異代謝物，探究不同花色秋石斛花青素合成的差異，旨在為秋石斛花色形成機(jī)制和花色改良及新品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 于2022年11月采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶花卉研究中心的熱帶蘭品種資源圃，收集5個(gè)代表性秋石斛品種水蜜桃（. Airey Peach，SMT，淺桃紅色）、紅珍珠（. Udomsri Beauty，HZZ，紫紅色）、迷你（. Yaya Victoria，MN，紫紅色）、黑貓（. Black Cat，HM，深紅色）、藍(lán)天使（. Blue Sapphire，T114，藍(lán)紫色）。進(jìn)行廣泛靶向代謝組分析，挑選植株健壯且無病蟲害的具有典型特征的新鮮花朵，摘下花瓣、萼片及唇瓣放入50 mL離心管中，置于液氮干燥冷凍后，放入–80 ℃冰箱保存。

1.1.2 代謝物提取 將新鮮樣品置于液氮中研磨，將研磨后的樣品置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，取干燥后的樣品精確稱量適量樣本于2 mL離心管中，加入1000 μL 60%甲醇溶液（含0.1 mol/L鹽酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%乙二胺四乙酸二鈉鹽），渦旋振蕩60 s；加入2顆鋼珠，放入組織研磨器（美壁MB-96）中，50 Hz研磨120 s；60%超聲功率在40 ℃下超聲10 min；12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液100 μL，加入400 μL 60%甲醇溶液（含0.1 mol/L鹽酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%乙二胺四乙酸二鈉鹽），混勻，過0.22 μm膜過濾，濾液加至棕色進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 色譜質(zhì)譜采集條件 色譜條件：Thermo Vanquish（Thermo Fisher Scientific, USA）超高效液相系統(tǒng)，使用ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm× 100 mm, 1.7 μm, Waters, Milford, MA, USA）色譜柱，流速為0.25 mL/min，柱溫為50 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。正離子模式，流動(dòng)相為1%甲酸水（A）和1%甲酸甲醇（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?.0～ 2.0 min，5% B；2.0～15.0 min，5%～70% B；15.0～ 15.1 min，70%～95% B；15.1～18.0 min，95% B；18.0～20.0 min，95%～5% B；20.0～25.0 min，5% B。

質(zhì)譜條件：Thermo Q Exactive 質(zhì)譜檢測(cè)器（Thermo Fisher Scientific, USA），電噴霧離子源（ESI）。正離子噴霧電壓為3.50 kV，鞘氣流速為47 arb，輔助氣流速為15 arb。毛細(xì)管溫度為320 ℃，以分辨率70 000進(jìn)行一級(jí)全掃描，一級(jí)離子掃描范圍150～1300/，并采用HCD進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞能量為10、50、60 eV，二級(jí)分辨率為17 500，采集信號(hào)前4離子進(jìn)行碎裂，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

1.2.2 花色表型的測(cè)定 利用分光色差儀（NF555型，日本電色工業(yè)株式會(huì)社）以光源C/2°為條件測(cè)量秋石斛花朵的顏色[8]。每個(gè)品種選取具典型顏色特征的花朵3～4朵，拆分出花瓣和唇瓣平置于白紙上，將集光孔對(duì)準(zhǔn)花瓣的主要顯色位置進(jìn)行測(cè)量，按CIE Lab表色系統(tǒng)測(cè)定花瓣的明度（L），色相a、b值。每朵花測(cè)定3次，取平均值。唇瓣同上操作。根據(jù)所測(cè)計(jì)算彩度（）和色相角（），根據(jù)公式計(jì)算：=(a2+b2)1/2，=arctan(b/a)。并將其換算為紅葡萄顏色指數(shù)CIRG=(180-)/ (L+C)，此參數(shù)與花青素苷呈指數(shù)關(guān)系，能很好地應(yīng)用于對(duì)紫色的顏色描述[19]。

1.2.3 總花青素的提取 將收集好的秋石斛花朵拆解出花瓣和唇瓣，用剪刀剪碎后放于培養(yǎng)皿中，避光，在冷凍干燥機(jī)（Labconco Freezone Plus, USA）中干燥12 h以上，取出干樣，用電子天平準(zhǔn)確稱取0.1 g或0.08 g，分裝至2 mL離心管，每管放2顆鋼珠，提前用液氮遇冷離心管和托盤，放于組織研磨機(jī)（Tissuelyser-96，上海凈信實(shí)業(yè)）中60 Hz功率研磨約90 s至粉末狀，取出鋼珠，將干樣置于–80 ℃保存。花瓣和唇瓣各重復(fù)3次。每個(gè)離心管中分裝約0.1 g秋石斛凍干樣品，再加入1 mL甲醇∶鹽酸∶水=70∶0.1∶29.9（//）的提取液，渦旋10 s并攪拌均勻后再加入1 mL提取液放入超聲清洗器中避光放入4 ℃提取24 h，取出后離心5 min（6000 r/min），轉(zhuǎn)移300 μL上清液至新的離心管中。加入50 μL氯仿以及300 μL HCl溶液（0.1%），劇烈震蕩。再次離心5 min（12 000 r/min），取200 μL上清液至酶標(biāo)板中，利用酶標(biāo)儀（TECAN Spark 10 mol/L, CH）測(cè)量在525 nm處供試花瓣中的總花青素苷含量（total anthocyanins content, TA）。稱取1 mg矢車菊素- 3--葡萄糖苷（購自北京索萊寶科技有限公司）溶于1 mL上述提取液中，制備成1 mL的母液。將矢車菊素-3--葡萄糖苷稀釋成200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7812 μg/mL 9個(gè)濃度梯度，根據(jù)吸光值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用半定量法計(jì)算每1 mg干重花瓣或唇瓣中未經(jīng)過水解處理的花青素苷的相對(duì)含量，以總花青素苷含量表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)公共數(shù)據(jù)庫KNApSAcK、HMDB、LipidMaps、PubChem、KEGG及諾米代謝自建物質(zhì)庫（蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司）進(jìn)行物質(zhì)鑒定，對(duì)樣本的代謝物進(jìn)行質(zhì)譜定性分析，采用R XCMS軟件包進(jìn)行峰檢測(cè)、峰過濾、峰對(duì)齊處理，得到物質(zhì)峰面積列表以及對(duì)應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量。數(shù)據(jù)質(zhì)控中過濾掉QC樣本中RSD>30%的物質(zhì)。采用R語言分別對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis, PCA）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)計(jì)算值，OPLS-DA降維方法計(jì)算變量投影重要度（variable importance in projection, VIP），結(jié)合差異倍數(shù)（fold change, FC）值，衡量各花青素組分含量對(duì)樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，輔助標(biāo)志花青素的篩選。采用SAS Studio軟件Duncan’s法評(píng)估主要花青素代謝物含量的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種的花色和總花青素苷含量

5個(gè)秋石斛品種間的花色呈顯著差異，通過對(duì)5個(gè)品種花瓣和唇瓣的*、和CIRG顏色參數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，淺桃紅色品種水蜜桃的花瓣和唇瓣的L值顯著大于其他品種（圖1A），而其花瓣值顯著小于其他品種（圖1B）；紫紅色品種迷你的值顯著高于其他品種；深紅色品種黑貓的花瓣和唇瓣的CIRG指數(shù)最高（圖1C），而值顯著低于其他品種。

測(cè)定其盛開期花朵的總花青素苷含量結(jié)果表明，黑貓品種的總花青素苷的含量顯著高于其他品種，其含量為其他品種的3～10倍；水蜜桃、迷你和藍(lán)天使的唇瓣的總花青素苷含量高于花瓣，而紅珍珠和黑貓品種則相反；水蜜桃品種的總花青素苷含量最低，其花瓣和唇瓣的總花青素苷含量分別為黑貓品種的9.2 %和13.8 %（圖1D）。

不同小寫字母表示品種間差異顯著（P<0.05）。

2.2 廣泛靶向花青素代謝組分析

2.2.1 數(shù)據(jù)結(jié)果評(píng)估 對(duì)5種秋石斛盛花期花進(jìn)行靶向代謝譜分析。經(jīng)色譜分離流出的組分不斷進(jìn)入質(zhì)譜，質(zhì)譜連續(xù)掃描進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。每一次掃描得到一張質(zhì)譜圖，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜圖中所有離子的強(qiáng)度加和后連續(xù)描繪，得到總離子流色譜圖（圖2），結(jié)果顯示總離子流的曲線重疊性高，表明質(zhì)譜信號(hào)穩(wěn)定性較好。

2.2.2 花青素定性和定量分析 花青素鑒定首先根據(jù)精確分子量進(jìn)行確認(rèn)，后續(xù)根據(jù)MS/MS碎片模式對(duì)KNApSAcK（http://metabolomics.jp）、HMDB（https://hmdb.ca）、LipidMaps（https://lipidmaps. org）、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、KEGG（https://www.genome.jp）以及諾米代謝自建標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫進(jìn)行算法注釋獲得花青素成分結(jié)果。對(duì)5個(gè)秋石斛品種的花青素成分進(jìn)行分析，共鑒定出38種代謝物，包括31種花青素苷、4種花青素元和3種其他花青素（表1）。對(duì)花青素種類與含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，14種矢車菊素和13種飛燕草素是構(gòu)成這5個(gè)品種花青素的主要成分，可達(dá)全部代謝物種類的70%，其余為2種天竺葵素、3種芍藥花素、3種矮牽牛素及3種其他花青素（圖3A）。秋石斛所含的5種花青素中矢車菊素含量最高，可達(dá)所有花青素含量的一半以上，飛燕草素含量次之，矮牽牛素、天竺葵素、芍藥花素較少，其中芍藥花素含量最少，僅占所有花青素含量的0.56%（圖3B）。

圖2 正離子檢測(cè)模式的TIC重疊圖

表1 供試秋石斛中的花青素成分

續(xù)表1 供試秋石斛中的花青素成分

Tab. 1 The anthocyanin components in Phalaenopsis-type Dendrobium (continued)

A：花青素種類；B：花青素含量。

鑒定出的所有代謝物均能在5個(gè)秋石斛品種中發(fā)現(xiàn)，但每個(gè)品種的花青素含量不同。藍(lán)天使品種的Cy型糖苷占花青素比例最高，Dp型糖苷則在迷你品種中相對(duì)含量最高；黑貓品種的Cy與Dp型糖苷的含量近似，而水蜜桃品種的花青素主要由Cy、Dp和Pt型糖苷構(gòu)成；與水蜜桃品種的糖苷組成比例類似，但紅珍珠品種的Dp型糖苷含量較高。

2.2.3 各組樣品與質(zhì)控樣本的主成分分析 對(duì)各組樣本與質(zhì)控樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（圖4）。利用主成分分析對(duì)15個(gè)秋石斛樣本和3個(gè)QC樣本的代謝產(chǎn)物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，顯示出各組間的分離趨勢(shì)及組內(nèi)差異，小組內(nèi)3個(gè)樣品被聚集到一起，此結(jié)果表明樣品重復(fù)性較好，組內(nèi)樣本點(diǎn)距離近，一致性高；組間樣本點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，分離趨勢(shì)明顯，差異性好。QC樣本密集分布，說明數(shù)據(jù)可靠。

2.2.4 不同品種秋石斛的共有差異代謝物分析 通過對(duì)鑒定出的花青素進(jìn)行篩選，從鑒定列表中尋找差異物質(zhì)。選擇的相關(guān)差異花青素篩選條件為<0.05且VIP>1，統(tǒng)計(jì)5個(gè)品種間的差異代謝物數(shù)量，通過維恩圖可展示各組差異代謝物之間的關(guān)系。

圖4 各組樣品與質(zhì)控樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)的PCA得分圖

由共同差異韋恩圖可知，藍(lán)紫色品種藍(lán)天使與其余4個(gè)品種的共同差異代謝物共有13種（圖5A）。差異代謝物整體的調(diào)控類型一致，說明藍(lán)紫色品種較為獨(dú)特。通過對(duì)共同差異代謝物（表2）分析發(fā)現(xiàn)，其中共同上調(diào)的差異代謝物為矮牽牛素--D-吡喃葡萄糖苷、飛燕草素3-槐糖苷、飛燕草素3-葡萄糖苷-5-(6-乙酰葡萄糖苷)、矢車菊素3-葡萄糖基蕓香糖苷、飛燕草苷3-[6￠- (42--對(duì)香豆酰鼠李糖基)葡萄糖苷]5-葡萄糖苷，主要差異花青素由Dp型糖苷和Pt型糖苷組成，且3種Dp型糖苷含量均顯著高于其他顏色。而矢車菊素3-刺槐雙糖苷-5-(6--對(duì)香豆素葡萄糖苷)顯著下調(diào)。

深紅色品種黑貓與紅珍珠、迷你和淺桃紅色品種水蜜桃的共同差異代謝物有12種（圖5B）。篩選其共同差異代謝物可知（表3），3種Dp型糖苷在黑貓中代謝類型為上調(diào)，另外矢車菊素3-(62-咖啡酰葡萄糖苷)-5-葡萄糖苷為構(gòu)成其上調(diào)差異花青素的主要成分。芍藥花素和矮牽牛素3-槐糖苷是黑貓品種共同下調(diào)的差異花青素，說明二者在深紅色品種黑貓中的代謝水平低。

圖5 秋石斛組間共同差異韋恩圖

表2 藍(lán)紫色藍(lán)天使與其他品種的共同差異代謝物

表3 深紅色黑貓分別與紅珍珠、迷你和水蜜桃的共同差異代謝物

紫紅色品種紅珍珠、迷你與淺桃紅色品種水蜜桃的共同差異代謝物有11種（圖5C），共同差異代謝物中上調(diào)的有5種（表4），以Cy型糖苷和Dp型糖苷為主，矢車菊素上調(diào)的種類較多，在紫紅色品種中富集矢車菊素，其中飛燕草素3-槐糖苷-5-葡萄糖苷的上調(diào)倍數(shù)顯著高于其他代謝物。在紫紅色品種中共同下調(diào)的花青素僅有矢車菊素3-半乳糖酸木糖苷和木樨黃定5,7-二葡萄糖苷。

表4 紅珍珠和迷你分別與淺桃紅色品種水蜜桃的共同差異代謝物

2.3 秋石斛花青素生物合成途徑解析

基于以上結(jié)果推測(cè)出秋石斛花青素生物合成途徑，并根據(jù)5個(gè)不同品種的秋石斛花青素的相對(duì)值為代謝水平進(jìn)行聚類分析，表明不同花色秋石斛中花青素代謝水平存在差異（圖6）。

3 討論

本研究采用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究了不同品種秋石斛花中花青素代謝物的組成和差異，從代謝產(chǎn)物水平初步揭示了不同花色秋石斛品種間的花色形成機(jī)制。

不同顏色表示相對(duì)含量的大小。Cy：矢車菊素；Pn：芍藥花素；Pg：天竺葵素；Pt：矮牽牛素；Dp：飛燕草素；R：蕓香糖苷；G：葡萄糖苷；Gal：半乳糖苷；S：槐糖苷；Rob：刺槐雙糖苷；Lat：半乳糖酸木糖苷；Mal：丙二酰；Rha：鼠李糖；Ace：乙酰；Caf：咖啡酰；Coum：香豆酰；CHS：查爾酮合成酶；CHI：查爾酮異構(gòu)酶；F3′H：黃烷酮-3′-羥化酶；F3′5′H：類黃酮-3′,5′-羥基化酶；DFR：二氫黃酮醇還原酶；ANS：花青素合成酶；GT：花青素葡萄糖轉(zhuǎn)移酶；AT：花青素苷酰基轉(zhuǎn)移酶；MT：花青素苷甲基轉(zhuǎn)移酶。

本研究發(fā)現(xiàn)秋石斛花青素苷主要是Cy、Pn、Pg、Dp和Pt的糖基化及酰基化衍生物。相較于KANCHIT[7]僅發(fā)現(xiàn)Cy、Pn和Pg三種類型的花青素，呂曉帆等[12-13]用UPLC-MS鑒定出幾種3-糖苷，本研究利用代謝組手段檢測(cè)到秋石斛中更多花青素代謝物種類，發(fā)現(xiàn)不同花色各種類花青素組成比例差異，豐富了目前對(duì)其組成及含量的認(rèn)知。然而本研究鑒定出的花青素苷并不包括前人從秋石斛中分離得到的4種主要成分——酰化的矢車菊素糖苷[10-12]。而且前期研究認(rèn)為桃紅色種質(zhì)中的主要成分為Pg型花青素[20]，與本研究中淺桃紅色水蜜桃由Cy型花青素組成不一致。筆者將水蜜桃花青素苷水解后，利用HPLC僅檢測(cè)到Pg苷元，可見其主要花青素為Pg型色素。這表明，目前流行的基于標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫的UPLC-MS方法在鑒定秋石斛花青素的組成方面存在明顯不足。其原因是數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建的花青素標(biāo)準(zhǔn)品種類有限。因此需要更多的花青素標(biāo)準(zhǔn)來補(bǔ)充定性分析數(shù)據(jù)庫，才能深入和準(zhǔn)確地研究秋石斛的花青素苷組成。

秋石斛花從小花芽到盛開過程中，花青素苷含量呈逐漸增加的趨勢(shì)，到盛開期達(dá)到峰值[21]，該時(shí)期各品種花色具有代表性，可作為花色評(píng)價(jià)的材料。各類花青素苷含量的變化是不同花色秋石斛品種間呈色差異的主要原因。花青素苷含量是影響花色明暗及色調(diào)的重要因素，隨著花青素苷含量的增加，秋石斛花瓣顏色變暗，逐漸轉(zhuǎn)為紫紅色和紫色[8]。本研究結(jié)果顯示，矢車菊素和飛燕草素在秋石斛花青素苷中占70%以上。隨著供試秋石斛顏色由淺桃紅、紫紅向深紅以及藍(lán)紫色變化，Cy型和Dp型色素含量顯著增加，由于Cy型色素是秋石斛呈色的主要成分[7]，也是諸多觀賞植物中紫紅色系花瓣呈色的物質(zhì)基礎(chǔ)[22]。由此推測(cè)隨著Cy型色素含量的增加，花色會(huì)加深為深紅色。

絕大多數(shù)藍(lán)色花是以Dp型色素為基礎(chǔ)形成的。如飛燕草素-3--葡萄糖苷是繡球花藍(lán)色形成的決定性物質(zhì)，其含量變化與藍(lán)色花的形成一致[23]。飛燕草素-3--葡萄糖苷的含量與花色的深淺呈正相關(guān)，且隨著薰衣草的花發(fā)育成熟，飛燕草素- 3--葡萄糖苷的含量也逐漸增多[24]。藍(lán)紫色秋石斛品種藍(lán)天使中的主要差異花青素由Dp型糖苷和Pt型糖苷組成，且3種Dp型糖苷含量均顯著高于其他品種，Dp的積累使花色向藍(lán)色偏移[25]，因而推測(cè)飛燕草素賦予秋石斛的藍(lán)紫色調(diào)。且前人和本研究均發(fā)現(xiàn)秋石斛花青素苷存在普遍的酰基化現(xiàn)象，酰基化也有利于花色藍(lán)化[26]。藍(lán)色秋石斛的育種策略可以在專一積累Dp型色素的基礎(chǔ)上，通過輔助著色、金屬絡(luò)合或芳香酰基化修飾進(jìn)一步形成較為穩(wěn)定的藍(lán)色大分子，從而培育出藍(lán)色的秋石斛新品種[27]。

在深紅色品種黑貓中共同下調(diào)的為Pn型色素。而在其他觀賞植物中，Pn型色素的積累使花色偏向藍(lán)紫色。Pn型色素是紫枝玫瑰花色形成紫色的主要因素[28]。本研究中僅發(fā)現(xiàn)在淺桃紅色品種中下調(diào)差異花青素有5種，以Cy型糖苷和Dp型糖苷為主，矢車菊素下調(diào)的種類較多。秋石斛原生種和雜交種水解后的花青素苷元中，發(fā)現(xiàn)以Cy為主，Pn較少，而Pg僅能在桃紅色種質(zhì)中檢測(cè)到[20]。錢大偉等[29]推測(cè)天竺葵色素是錦繡杜鵑粉花品種粉鶴花瓣呈現(xiàn)粉紅色的主要原因。DENG等[30]研究發(fā)現(xiàn)紅色非洲菊的關(guān)鍵花青素是天竺葵素。對(duì)于純紅色花的育種可以降低黃酮醇合成酶的活性，增加花青素苷的積累，減少類黃酮-3￠-羥化酶的合成，阻斷矢車菊素的通路，大量積累天竺葵素。如在白色的矮牽牛中成功轉(zhuǎn)化其他觀賞植物的基因，使轉(zhuǎn)基因植株的花瓣中積累了天竺葵色素苷，花色變成了紅色[31]。

由于秋石斛花青素苷的復(fù)雜性以及代謝組學(xué)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫尚不完善，代謝通路不夠全面，尚未能將秋石斛中花青素組成完全解析。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，鑒定與識(shí)別代謝物的能力不斷提高，將為闡明秋石斛花色的形成機(jī)理，為花色改良定向育種提供指導(dǎo)。

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Metabolomics Analysis of Anthocyanin in Different Flower Colors ofType

WU Meiqing1,2, LIAO Yi2,3, LU Shunjiao2,3, YIN Hantai1,2, YU Wengang1*, LI Chonghui2,3*

1. College of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Tropical Crop Germplasm Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation of Hainan Province, Haikou, Hainan 571101, China; 3. Hainan Provincial Engineering Technology Research Center of Tropical Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Danzhou, Hainan 571737, China

In order to further investigate the anthocyanin biosynthetic pathway intype(Den-Phals) varieties with different flower color, this study used widely targeted metabolomics technology to analyze the anthocyanin composition and content of five Den-Phals varieties with blue-purple, light peach-red, red, purple-red and deep purple-red floral color, respectively. The results showed that a total of 38 metabolites were identified from the tested Den-Phals, most of which were glycosides and acylated derivatives of cyanidin (Cy), peonidin (Pn), pelargonidin (Pg), delphinidin (Dp) and petunidin (Pt). There were significant differences in the composition and content of anthocyanin in five Den-Phals varieties. Metabolite difference analysis showed that Cy and Dp glycosides in purple flowers were significantly higher than those in light peach red flowers. The contents of three Dp-type glycosides in blue-purple flowers were significantly higher than those in other colored varieties. Only one Cy-type glycoside was screened out, and the content of which in light pink flowers was high. The content of Cy-type glycosides was the highest in most samples. With the increase of cyanidin and delphinidin and the derivatives, the color of flowers deepened and turned to red-purple. It was speculated that Cy-type glycosides made Den-Phals tend to purple while Dp glycosides gave Den-Phals a blue-purple tone. Based on the above results, it is speculated that there are acylation synthesis pathways of the above five anthocyanins in Den-Phals, which can provide a basis for flower color formation mechanism and flower color improvement of Den-Phals.

type; flower color; metabolome; anthocyanins

S682.31

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.004

2023-07-26；

2023-09-12

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（No. 1630032022002）；海南省自然科學(xué)基金高層次人才項(xiàng)目（No. 321RC 648）。

武美卿（1999—），女，碩士研究生，研究方向：觀賞園藝學(xué)。*通信作者（Corresponding author）：李崇暉（LI Chonghui），E-mail：blchh@sina.com；余文剛（YU Wengang），E-mail：yuwg2008@hainanu.edu.cn。