mRNAs/microRNAs調控網絡探索石斛花型差異分子機理研究

臧 睿，陳 宇，趙 美，郝玉恒，敖 疊，李凱莉，方詩迪，趙奇明，和鳳美

mRNAs/microRNAs調控網絡探索石斛花型差異分子機理研究

臧 睿，陳 宇，趙 美，郝玉恒，敖 疊，李凱莉，方詩迪，趙奇明，和鳳美*

云南農業大學園林園藝學院，云南昆明 650201

目前蘭科植物花型多樣性形成分子機理仍不清楚，本研究對鐵皮石斛、美花石斛花器官進行轉錄組和microRNA測序，通過cytoscape構建miRNA-mRNA網絡和靶基因蛋白互作網絡并進行差異比較，以期在分子水平上探究2種石斛花型差異分子機理。轉錄組研究結果表明，與花發育相關的mRNAs有MADS-box基因、激素類基因等。miRNA-mRNA網絡分析表明，差異表達的miRNAs、mRNAs參與了花型差異形成，miR5179與靶基因、miR160與靶基因、miR164與靶基因、miR159與靶基因、bdi-miR159與靶基因、miR167b-3p與靶基因可能參與花型形成，以上miRNA均在鐵皮石斛中上調表達。蛋白互作通路表明，2種石斛有這一關鍵基因，美花石斛缺少、、、四個基因；2種石斛的生長素反應互作通路中存在2個差異表達的基因，美花石斛缺失1個基因；美花石斛特異性地擁有由基因構成的生長素信號轉導靶基因蛋白互作通路。鐵皮石斛和美花石斛花型差異表達miRNAs/mRNAs以及靶基因蛋白互作差異可能是導致2種石斛花型差異的主要機理。

鐵皮石斛；美花石斛；花型；轉錄組；small RNA；調控網絡

MicroRNAs（miRNAs）是由單鏈前體（pre- miRNAs）自發配對形成發夾狀結構，并在轉錄后通過介導靶基因RNA的降解或抑制蛋白質的翻譯調控基因表達的非編碼小RNA（small RNAs, sRNAs）。在植物葉和根的形態發生、花的誘導、器官發生、繁殖和脅迫響應等逆向生物學過程中發揮重要作用[1-3]。根據前人研究意大利蘭的花序中一個MADS-box/（）轉錄本被miR5179同源物所切割[4]，在水稻中存在miR5179靶向調控MADS-box類基因[5]。基因有調控多元化花被片和唇瓣的功能，表明在進化過程中存在miRNA介導的花發育調控機制。此外miRNA172 作為的負調控因子可抑制基因表達，花期提前，使花瓣數目減少[6-7]。蘋果、擬南芥中均有miR160-Auxin響應因子（）[8-9]。miR164家族（miR164a, miR164b, miR164c）與其靶基因NAC（與）間的關系決定了植物花型的完整性[10]。在春蘭中，miR319/TCP4-miR396/聯級調控多膜細胞增殖發育[11]。

目前對花模式和花型發育的分子機制的了解還很有限，蘭科植物花器官高度特化，形態多樣，為花的形態調控分子機理的研究提供了素材模式[12-13]。鐵皮石斛（）和美花石斛（）花器官迥異，唇瓣形態差異巨大，鐵皮石斛唇瓣為反折的卵狀披針形，美花石斛的唇瓣邊緣具短流蘇呈筒狀向內翻卷的近圓形[14]，是研究花器官形態差異分子機理的理想材料。本研究通過高通量測序技術檢測2種石斛的差異顯著的花器官，對microRNA和mRNA表達譜進行分析，構建miRNA-mRNA調控網絡，以期識別對2種花型形成起到調控作用的差異miRNAs及調控的靶點，以及靶基因互作差異，以期了解石斛屬植物負責調控花被表型及調控花形態發生的分子調控機制，并為未來蘭花分子植物育種提供一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用的鐵皮石斛、美花石斛組織培養苗種植于云南農業大學園林園藝學院基地大棚，開花時期采摘其花蕾放入液氮凍存。

1.2 方法

1.2.1 轉錄組及micro RNA文庫的構建與測序 采用Trizol試劑分別提取鐵皮石斛和美花石斛不同大小花蕾總RNA，cDNA文庫和小RNAs文庫構建和測序方法參考文獻[15-19]，測序工作由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.2.2 轉錄組功能注釋 使用Diamond軟件在NR、Swiss-Prot、COG數據庫進行序列比對，使用Blast2g、HMMER軟件分別在GO、Pfam數據庫比對，使用KOBAS2.1軟件獲得KEGG Orthology結果。

1.2.3 miRNAs鑒定 在Illumina測序平臺進行small RNA測序。測序得到的原始數據經過濾后得到有效序列，有效序列經比對和軟件預測分別得到鐵皮石斛和美花石斛文庫，以及保守miRNAs和新miRNAs，具體方法參考文獻[20-21]。

1.2.4 DEGs分析 利用RSEM分析表達水平，定量指標為TPM（transcripts per million reads）?；诒磉_量定量結果，使用DEGseq進行組間差異基因分析，對不同樣品間的raw counts進行標準化處理，|log2FC|≥1 & padjust<0.001作為過濾條件，篩選差異表達的 miRNAs和mRNAs，采用BH（fdr correction with Benjamini/Hochberg）對-value進行矯正。

1.2.5 miRNA- mRNA調控網絡的構建 使用psRobot預測miRNAs的靶基因，對miRNA與mRNA的表達量進行關聯分析，獲得表達相關性（正調控或負調控），使用Cytoscape軟件可視化。設置TSS上游5000到下游1000，-value閾值（FIMO）為0.000 05。

1.2.6 蛋白互作網絡構建 使用STRING數據庫進行蛋白互作網絡分析，獲得蛋白互作關系（protein-protein interaction, PPI），將所得結果導入Cytoscape軟件中進行可視化處理，構建PPI網絡。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛、美花石斛的花器官形態學特征比較分析

鐵皮石斛與美花石斛花型有很高觀賞價值，其中唇瓣是主要觀賞部位，表形差別最大。鐵皮石斛具長圓披針形萼片和花瓣，萼片長約1.8 cm，寬4～5 mm，具5條脈；唇瓣基部具1個綠色或黃色的胼胝體，卵狀披針形，中部反折（圖1A）。美花石斛花瓣與萼片近似呈卵狀披針形，寬8～9 mm；唇瓣近圓形，直徑1.7～2.0 cm，上面中央金黃色，呈筒狀向內翻卷，邊緣具短流蘇，兩面密布短柔毛（圖1B）。

圖1 鐵皮石斛（A）和美花石斛（B）完全開放的花器官

2.2 轉錄組測序組裝及分析

本研究檢測到2種石斛的表達基因共26 789個。鐵皮石斛25 821個，其中已知基因21 169個，新基因4652個；美花石斛21 586個，其中已知基因19 546個，新基因2040個。共有22 724（88.01%）、21 058（97.55%）個序列得到注釋。

2.3 花發育、激素反應相關基因分析

鐵皮石斛中獲得92個與花發育相關的基因，根據功能注釋和序列比對，其中AP2類基因6個，MADS-box家族基因63個，NAC類基因4個，MYB類基因3個，TCP家族基因16個（圖2）。美花石斛中獲得69個與花發育相關的基因，其中AP2類基因6個，MADS-box家族基因42個，NAC類基因5個，MYB類基因2個，TCP家族基因14個（圖3）。與激素反應（Auxin、GA、CTK、ABA、BR）有關的基因，鐵皮石斛中有206個，美花石斛中有193個。

2.4 miRNA分析及靶基因預測

sRNA統計中鐵皮石斛、美花石斛的miRNA序列分別有226 904、79 225個。而miRNA成熟體分別為2755、2230個，其中2600、2185個為已知miRNAs，155、45個為未知miRNAs。鐵皮石斛、美花石斛中表達量最高的是miR319家族，此外，miR535、miR159和miR171家族等也有高豐度的表達。

圖2 鐵皮石斛與花型發育有關基因統計

圖3 美花石斛與花型發育有關基因統計

Fig. 3 Statistics of genes involved to floral development in D. loddigesii

鐵皮石斛有2496個miRNA預測到了1264個靶基因，6個未知miRNAs；美花石斛有2076個miRNA預測到了1609個靶基因，2個未知miRNAs，根據其靶向關系，存在一個基因被多個miRNA靶向，一個miRNA靶向多個基因。這些miRNA的靶基因大多被歸類為轉錄因子，如MADS-box轉錄因子（miR5179）、MYB家族轉錄因子（miR159、miR319）等。其他一些基因被歸類為功能性基因蛋白質，如F-box蛋白（miR393、miR394）、cytokinin dehydrogenase 4-like（miR159）等，均參與植物的代謝和環境刺激反應。Novel miRNA的靶基因大多歸類為未知功能基因。

2.5 與花型發育有關的miRNA及其靶基因

本項目擁有2個共表達的miR5179家族成員osa-miR5179和bdi-miR5179，成熟序列相同（UUUUGCUCAAGACCGCGCAAC），長度為21 bp，且定位到參考基因組上，靶向2個差異表達的基因，根據序列比對（LOC110093040）為基因，（LOC110103364）為基因，它們可能是2種石斛花型形成的關鍵差異miRNA及靶基因。miR319、miR159共同調控2個參與花器官發育且為赤霉素轉錄激活因子（）的MYB類基因，ath-miR5021調控與花型發育有關的4個TCP家族基因；3個的基因與miR172相互作用，miR164調控2個與花型發育相關的NAC家族基因；此外miR167與2個作為生長素轉錄因子的基因（）相互作用，bdi-miR159c調控1個催化細胞分裂素的氧化基因（），miR160靶向4個作為生長素轉錄因子的基因（），miR167靶向。另外，miR408、miR528也調控生長素轉錄因子的表達。這與前人的研究結果一致，因此，推測以上miRNA及其靶基因為花型形成候選miRNA和靶基因。

2.6 miRNA-mRNA調控網絡構建

將表達miRNA及其靶標進行miRNA-mRNA關聯分析，最后將數據導入Cytosc-ape軟件對miRNA-mRNA調控網絡進行可視化處理，篩選與花型形成有關miRNA及其靶基因，得到22個共表達的靶基因及其相關miRNA，和在鐵皮石斛中特異性表達的vca-miR167b-3p及其靶基因（表1）。

表1 miRNA-mRNA調控網絡中與花型發育有關的miRNA及其靶基因統計

將關聯分析得到與花型形成有關的共表達miRNA及其靶基因進行差異分析，刪除無顯著差異靶點，得到6個與花型形成有關的關聯網絡（圖4～圖6）。鐵皮石斛特異表達的vca-miR167b-3p作用靶基因為（圖4A）；2個miR160負向調控生長素反應因子（）(LOC110109117)（LOC110102977），其中miR160在鐵皮石斛中上調表達，2個靶基因在美花石斛中上調表達（圖4B）；在鐵皮石斛中上調表達的2個miR5179正向調控2個差異表達的類靶基因，（LOC110093040）在美花石斛中上調表達，（LOC110103364）在鐵皮石斛中上調表達（圖4C）；bdi-miR159c及其靶基因在鐵皮石斛中上調表達（圖4D）；88個miR164在鐵皮石斛中上調表達負向調控2個NAC家族基因，LOC110104882被88 個miR164靶向，LOC110116607被87個miR164靶向，2個靶基因在美花石斛中上調表達（圖5）；44個miR159在鐵皮石斛中上調表達，2個MYB家族靶基因在美花石斛中上調表達并呈負調控關系（圖6）。

圖4 miR167（A）、miR160（B）、miR5179（C）、miR159（D）調控網絡

圖5 miR164調控網絡

圖6 miR159調控網絡

2.7 靶基因PPI網絡

借助STRING數據庫和Cytoscape軟件對2種石斛構建PPI網絡，在可視化網絡篩選關聯分析得到的靶基因。鐵皮石斛與美花石斛花發育相關的蛋白互作通路和生長素反應互作通路各不相同。鐵皮石斛花發育互作通路中（LOC110103364）基因表達量遠高于美花石斛，（LOC110093040）基因表達量遠底于美花石斛，美花石斛缺少、、、四個節點基因。生長素反應互作通路中在鐵皮石斛中表達量高于美花石斛，美花石斛缺失（LOC110110803）節點基因，而且特異性擁有一條基因組成的生長素信號轉導靶基因蛋白互作通路（圖7，圖8）。

A：與花型形成（MADS-box）、生長素、乙烯反應有關蛋白互作通路；B：與生長素反應有關通路。

A：與花型形成（MADS-box）有關基因蛋白互作通路；B：與生長素反應有關通路；C：與生長素（NAC）有關通路。

A: Protein interaction pathways related to floral type formation (MADS-box) and auxin response; B: Protein interaction pathways related to the auxin response; C: Pathways related to auxin.

圖8 美花石斛靶基因蛋白互作通路圖

Fig. 8 Diagram of target gene protein interaction pathways in

3 討論

根據前人研究，MADS-box家族基因在調控花型形成中發揮重要作用，其中AP3亞家族作為ABCDE模型的B類基因具有調控多元化花被片和唇瓣的功能[22]，包括、和等3個進化枝，通常只在花瓣中特異性高表達并作為身份特征基因，是石斛蘭的花器官發育的重要基因[23]。根據轉錄組數據分析顯示，一個在美花石斛中上調表達的基因和在鐵皮石斛中上調表達的基因或許是致使2種石斛花型和唇瓣結構差異的關鍵基因。此外已有研究表明，意大利蘭和水稻的花序中miR5179同源物靶向轉錄本[4-5]，表明在花器官發育過程中存在miRNA介導的花發育調控機制，且在 miRNA-mRNA調控網絡中，miR5179在鐵皮石斛上調表達并靶向MADS-box B類基因，因此認為的差異表達可能與miR5179的差異調控有關，說明石斛蘭中同樣存在miR5179靶向基因表達的現象，miR5179可能是石斛花型發育的關鍵差異調控分子，miR5179-AP3花型發育調控機制可能是石斛蘭花型形成mRNAs/ microRNAs調控網絡的重要組成部分。

作為一個A類AP2同源基因可促進花瓣細胞的特性，參與花器官的起始和發育，維持細胞的分生組織能力，在器官發生過程中維持細胞周期調節因子的表達，從而通過控制細胞數量調控花器官大小，參與花器官發育調節的自誘導和表達模式調節花器官發育，并介導花模型2輪中的基因的下調[24]。本研究中一個在鐵皮石斛特異性表達的miR167靶向差異顯著基因，表明2種石斛的差異表達可能與該miRNA的缺失有關，因此認為miR167-可能是花器官發育的關鍵通路。

此外部分激素有關基因也與花型形成有關。NAC基因具有調控生長素合成的作用，本研究中存在差異表達的，是生長素信號轉導轉錄激活因子，在擬南芥轉導（生長素受體蛋白）下游的生長素信號，可激活2個下游生長素應答基因和的表達[25]。在鐵皮石斛的PPI網絡中與（花葉分生組織特性因子）互作，而與4個基因互作，包括差異表達的，所以基因作為生長素調控通路的關鍵基因可能間接影響了基因的表達，從而在2種石斛花型形成過程發揮作用。已知在核桃等其他園藝植物中miR164靶向NAC家族基因的表達[26]，本研究miRNA-mRNA調控網絡中差異表達的miR164靶向基因，表明在蘭科植物中同樣存在miR164-NAC調控機制。

MYB家族基因為大麥GAMYB同源轉錄因子，是糊粉蛋白細胞中赤霉素依賴性淀粉酶表達的轉錄激活因子，可能與淀粉酶啟動子的5'-TAACAAA-3' box結合參與花粉和花器官的發育[27]。miR159是植物中一類古老保守的microRNA，其靶基因主要是一類編碼R2R3 MYB轉錄因子的GAMYB-like基因。miR159-GAMYB途徑高度保守，miR159通過轉錄后調控GAMYB在植物花器官發育中發揮著重要作用[28]。本研究中差異表達的miR159靶向調控了2個差異顯著的，說明2種石斛中存在miR159-GAMYB花器官發育調控機制，miR159可能通過靶向的表達從而調控石斛蘭的花器官發育，影響花型形成。

細胞分裂素脫氫酶（CKX）對CK具有強底物專一性，是目前已知的唯一參與CK降解過程的酶，已有研究表明，CKX在植物體內以多基因家族的形式存在，在系統進化樹上可分為4組，但不同的CKX基因家族成員都包含FAD和Cytokinine兩個保守的結合域[29]，在本研究關聯分析中差異表達的bdi-miR159c靶向，使該基因在鐵皮石斛中上調表達。生長素響應因子參與的TIR1/AFB-Aux/IAA-ARF信號通路是植物體內最重要的信號通路之一，ARF家族成員在信號通路中的表達可以調控植物體內如花器官發育等多種生物學過程[30]，參與花器官的發育差異表達的miR160-ARF（Auxin響應因子），在蘋果、擬南芥中均有體現[8-9]，這與本研究結果一致。

MADS-box蛋白互作差異可能導致石斛蘭花型差異的關鍵，2種石斛中均存在4個B類（）花同源性基因并與花葉分生組織特性因子（）互作，其中存在差異表達的節點、，且這2個節點在miRNA-mRNA調控網絡中被miR5179靶向。研究表明許多激素信號通路直接或間接參與花器官發育調控，目前研究發現多種激素都是MADS-box的潛在靶點，直接或者間接參與植物生長發育、花器官形態建成等過程。在鐵皮石斛中存在花模式和激素反應有關基因構成的調控網絡，可與F-box蛋白形成復合物，該復合物在花器官發育和生長素反應過程中發揮調控作用[31]，且在鐵皮石斛PPI互作網絡中F-box蛋白和（生長素受體蛋白）與為互作關系。（）復合物正向調控B類（）花同源性基因，（）復合物作為生長素受體介導蛋白的蛋白酶降解和調控生長素因子的轉錄，這與本研究結果一致，美花石斛PII網絡中則缺少基因，這可能是其花型存在差異的原因之一。此外互作通路中美花石斛缺少節點（LOC110110803），鐵皮石斛則缺少NAC互作通路，PPI網絡中、、等節點均在mRNA-miRNA調控網絡顯示。

綜上所述，本研究借助生物信息學成功篩選并構建了2種石斛的miRNA-mRNA網絡和PPI網絡，發現2種石斛與花型形成有關的關聯網絡和蛋白互作關系，探討了可能與花型形成有關的分子發育機制，為今后闡明石斛屬植物花型形成的分子調控機制提供重要的線索，為分子植物育種提供數據支撐和參考依據。此外本研究存在一些不足，由于篩選條件的限制，只能根據前人研究對關鍵mRNA和miRNA進行分析，研究結果具有局限性；缺乏證明miRNA-mRNA 調控網絡中靶向關系驗證實驗。在后續的研究中應通過相關實驗進一步討論和驗證本研究的預測。

4 結論

從鐵皮石斛、美花石斛分析發現的miR5179- AP3、miR167-ANT、miR164-NAC、miR159- GAMYB、miR159-CKX、miR160-ARF關聯通路可能是石斛屬植物花型差異的關鍵miRNA-mRNA通路。其通路中的部分基因如、、則是PPI網絡中的關鍵節點。以上miRNA、mRNA共同構成分子調控網絡調控石斛的花型差異。

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Differential Molecular Mechanism ofFlower Pattern Using mRNAs/microRNAs Regulatory Network

ZANG Rui, CHEN Yu, ZHAO Mei, HAO Yuheng, AO Die, LI Kaili, FANG Shidi, ZHAO Qiming, HE Fengmei*

College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China

The molecular mechanism of the formation of flower diversity is still unclear. In this study, the transcriptome and microRNA sequencing ofandflower organs were performed, and the miRNA-mRNA network and target protein interaction network were constructed by cytoscape and compared at the molecular level.The results of transcriptome studies showed that mRNAs related to flower development had MADS-boxgene, hormone genes, etc.The miRNA-mRNA network analysis showed that the differentially expressed miRNAs and mRNAs were involved in the differential formation of floral pattern, and miR5179 and its target genes, miR160 and their target genes, miR164 and its target genes, miR159 and the target genes, bdi-miR159 and the target genes, miR167b-3p and the target genesmay be involved in floral pattern formation, and the above miRNA was upregulated in.The protein interaction pathway showed that two kinds of dendrobium had the key gene of,lacked four genes:,,and; there weret wo differentially expressedgenes in the auxin response interaction pathway of two, andlacked onegene;flora specifically possessed the protein interaction pathway of auxin signal transduction target genes constituted by thegene.Differential expression of miRNAs/mRNAs inandand protein interaction of target genes may be the main mechanisms leading to the difference between the twoflower types.

;; flower pattern; transcriptome; small RNA; regulatory network

S682.31

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.005

2023-02-02；

2023-02-17

國家自然科學基金項目（No. 32260419）；研究生創新課題（No. 2022ZKY463）。

臧 睿（1998—），女，碩士研究生，研究方向：分子植物育種。*通信作者（Corresponding author）：和鳳美（HE Fengmei），E-mail：hefengmei918@126.com。