基于網絡藥理學的康復新液治療胃潰瘍的機理研究

薛豐富，寇繼光

［錦州醫科大學研究生培養基地（孝感市中心醫院），湖北 孝感 432100］

胃潰瘍（gastric ulcer）是臨床上常見的消化疾病，具有多種復雜的病因，例如幽門螺桿菌感染、非甾體抗炎藥物的使用、吸煙飲酒和應激、細胞因子的基因多態性、胃腸道微生物組生態失調、地理、氣候等［1］。胃潰瘍的癥狀包括胃痛、體重減輕、惡心、嘔吐等，累及肌層甚至漿膜層血管可能出現嚴重出血或穿孔等［2］，同時慢性胃潰瘍患者2 年內發生胃癌的風險遠高于普通人群［3］，因此，臨床上需重視并且采取有效措施治療胃潰瘍。目前，合成藥物如PPI 等可有效抑制胃酸分泌，從對胃潰瘍有著良好的療效，但長期使用上述藥物具有一定的副作用，如引起胃組織病理學改變，例如頂葉細胞突出到腺腔、胃底腺囊性擴張和中央凹上皮增生等［4］。目前的研究證明，一些草藥和動物藥材為基礎的中藥對胃潰瘍具有非常好的療效［5-8］?？祻托乱旱闹饕煞譃槊乐薮篌垢稍锵x體提取物，先前的許多研究都集中在美洲大蠊對人類住所的侵擾和傳播致病真菌的能力上［9］，然而，越來越多的生理和藥理學研究表明，美洲大蠊具有促進組織修復、抗菌、抗腫瘤等功能［10］。近年來，康復新液在多種疾病中得到運用［11-13］，特別是在胃潰瘍中，有著令人滿意的療效［14-18］。近年來，基于生物信息學，系統生物學和多藥理學的快速進展，萌生了網絡藥理學這一新興的研究方法［19］，即通過各類藥物、疾病、基因等數據庫，構建藥物、疾病、靶點、途徑等相連接的互作網絡，從而達到分析藥物機制、篩選作用通路的目的，對藥物及疾病研究有巨大的推動作用?？祻托乱涸谖笣冾I域已得到成熟應用，但目前暫無相關基于網絡藥理學的研究，本研究基于網絡藥理及分子對接探究康復新液對胃潰瘍作用的潛在機制，初步發現康復新液作用于胃潰瘍的靶點，為進一步應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 有效化學成分篩選

目前TCMSP 數據庫（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/Tcmsp.php）中暫無美洲大蠊相關的藥物成分及成分靶點，因此我們通過CNKI 數據庫及PubMed 數據庫進行相關文獻檢索篩選出美洲大蠊的12 種有效化學成分，分別為胞嘧啶、胞苷、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鳥苷、腺嘌呤、次黃嘌呤、肌苷、尿苷、cyclo-(L-Val-L-Pro)、熊果苷、(E)-3-hexenyl-β-D-glucopyranoside。

1.2 藥物的靶點預測

將美洲大蠊的有效化學成分導入PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以獲得化合物的SMILES，PubChem 中檢索不到的化合物則使用ChemDraw 軟件（V20.0）進行化學結構的畫圖，將結果導入Super-PRED 數據庫中（https：//prediction.charite.de/subpages/target_prediction.php）用于獲取預測靶點，該數據庫于2022 年3 月完成了更新［20］。

1.3 藥物與疾病相關靶點篩選

以“gastric ulcer”及“stomach ulcer”為關鍵詞于OMIM（http：//www.omim.org/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、PharmGkb數據庫（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）及drugbank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）中進行檢索，其中對GeneCards 數據庫檢索結果以relevance score＞1 進行篩選，整合上述5 數據庫的基因，以獲得較完善的疾病相關靶點，并去除重復項。最后，利用韋恩圖取藥物靶點基因與疾病靶點基因的交集基因。

1.4 網絡建設與分析

1.4.1 復合目標網絡的構建 將康復新液的藥物成分及其治療胃潰瘍的潛在靶點引入Cytoscape 3.9.0，構建藥物活性成分和疾病靶點的網絡圖，同時進行分析，以degree 值來設置基因的大小的展示。

1.4.2 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建 將藥物與疾病交集基因通過String 數據庫（https：//string-db.org/）進行分析，最小相互作用打分閾值設置為0.4，得到蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡圖，同時利用Cytoscape 3.9.0 軟件實現網絡可視化，利用Cytoscape 中的“Cytohubba”插件，進行關鍵基因篩選。

1.4.3 富集分析 使用R 4.1.2 中的“clusterprofiler”包對關鍵基因進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路進行富集分析，以調整后的P＜0.05 且q＜0.05 作為閾值篩選有統計學意義的通路，以闡明康復新液治療胃潰瘍的潛在愈合機制。

2 結果

2.1 美洲大蠊中的活性成分及靶點

從文獻中篩選出的12 種化合物共有1 273 個預測靶點，化合物與預測靶點數見表1，然后刪除重復基因，得到370 個藥物靶點。

表1 美洲大蠊中的活性成分及預測靶點數目

2.2 康復新液治療胃潰瘍的靶點基因

通過上述5 個疾病數據庫得到5 964 個胃潰瘍相關靶點（圖1），利用韋恩圖取藥物靶點基因與疾病靶點基因的交集基因共134 個（圖2）。

圖1 胃潰瘍相關靶點韋恩圖

圖2 康復新液與胃潰瘍靶點韋恩圖

2.3 化合物-靶標網絡

以康復新液與胃潰瘍的134 個共同靶基因建立藥物成分靶點網絡圖（圖3）。其中，節點表示靶基因和藥物成分，邊緣表示藥物成分和靶基因之間的相互作用?？偣灿?46 個節點和503 條邊。12 種化合物分別作用于多個靶點。根據Degree 由高到低排序篩選可能的關鍵成分：cyclo-(L-Val-L-Pro)（Degree=64）、腺嘌呤（Degree=56）、鳥苷（Degree=44）。

圖3 藥物成分靶點網絡圖

2.4 蛋白-蛋白互作網絡

將藥物與疾病交集基因通過String 數據庫進行分析，得到了一個蛋白質相互作用網絡（圖4），該網絡有126 個蛋白質節點，1 174 條邊。利用CytoNCA 插件對節點的 Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、LAC、Network（NC）進行分析，選取出上述指標均大于平均值的節點進行新的網絡構建，得到一個節點數目為36 的互作網絡（圖5），重復上述操作，最終得到一個13 個節點、122 條邊的互作網絡，13 個節點即為康復新液治療胃潰瘍的潛在關鍵基因（圖6），分別為STAT3、HSP90AA1、MTOR、MMP9、EZH2、CXCR4、MMP2、PTGS2、TLR4、CDK2、PTPN11、GSK3B、PDGFRB。

圖4 蛋白質相互作用網絡

圖5 第一次篩選后的關鍵基因

圖6 第二次篩選后的關鍵基因

2.5 GO 富集分析

使用R 4.1.2 中的“clusterprofiler”包對關鍵基因進行基因本體論（GO）分析，以P＜0.05 且q＜0.05 為閾值，共包括三個方面：分子功能（MF），細胞成分（CC）和生物過程（BP），共篩選出1 535 條結果，顯示三個方面中排名前20 的結果（圖7）。其中，生物過程包括MAPK 級聯正調控、對氧氣水平的反應、對氧化應激的反應、細胞對氧化應激的反應、細胞因子產生的正向調節等；細胞成分包括膜筏、粘著斑、質膜的外側面、細胞基質結等；分子功能包括跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性等。

圖7 GO 分析

2.6 KEGG 富集分析

將PPI 網絡中獲得的靶基因用R 4.1.2 中的“clusterprofiler”包進行KEGG 富集分析，以調整后的P＜0.05 作為閾值篩選有統計學意義的通路，共篩選出70 條信號通路，選取出排名前30 的信號通路來闡明康復新液治療胃潰瘍的潛在愈合機制，主要富集于JAK-STAT、PI3K-Akt、HIF-1、MAPK 信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、T 輔助細胞17 細胞分化等（圖8）。

圖8 KEGG 富集分析

3 討論

康復新液的主要成分為美洲大蠊干燥蟲體提取物，其在胃潰瘍中的治療得到了越來越廣泛的應用［14-18］。本文從文獻中篩選出9 個康復新液活性成分，構建藥物活性成分與胃潰瘍共同靶點的PPI 網絡，經過篩選后得出13 個關鍵靶點，即STAT3、HSP90AA1、MTOR、MMP9、EZH2、CXCR4、MMP2、PTGS2、TLR4、CDK2、PTPN11、GSK3B、PDGFRB。將上述靶點進行GO與KEGG 富集分析，表明康復新液對胃潰瘍的治療作用涉及多種機制，包括減少化學刺激、抗氧化應激、減少炎癥反應、調控細胞因子等。

3.1 康復新液通過減少化學刺激及抗氧化應激治療胃潰瘍

胃潰瘍的發生機制涉及多個方面，當胃黏膜屏障受到如幽門螺旋桿菌、非甾體抗炎藥、酒精刺激、應激等有害因素累及時，血管與微血管的損傷會誘導黏膜缺血、缺氧、及自由基的形成，從而導致細胞壞死［21］，本研究中GO 富集分析表明，康復新液對胃潰瘍治療的生物學過程體現在細胞對化學應激的反應、氧化應激反應、對氧氣水平的反應、細胞對氧化應激的反應、對兒茶酚胺刺激的反應上，與上述胃潰瘍的發生機制相符合，特別集中于對氧化應激的反應。

從PPI 網絡中分析得到的關鍵靶點中，MMP-9 與MMP-2 被證實在酒精或吲哚美辛誘導的胃潰瘍中表達增加［22-24］，也有隊列研究證實，MMPs 基因多態性與胃潰瘍的進展有關［25-26］，MMPs 對胃潰瘍的發病機制涉及對細胞外基質（ECM）重塑，傷口愈合和血管生成等［27-29］，而MMPs 的激活受活性氧（ROS）影響［30］，因此MMP-9 與MMP-2 可能是康復新液作用于胃潰瘍的關鍵靶點。

3.2 康復新液通過減少炎癥反應治療胃潰瘍

除上述機制外，壞死的胃組織壞死釋放吸引白細胞和巨噬細胞，使其吞噬壞死組織并釋放促炎因子（例如TNF-α、IL-6 等），它們介導的炎癥反應又可以加重黏膜損傷和組織壞死。研究表明，PI3K-Akt 信號通路與MAPK 信號通路可以通過調節上述促炎細胞因子來緩解胃潰瘍，本研究富集分析表明，PI3K-Akt 信號通路在KEGG 富集分析中被富集，而GO 富集分析則富集了MAPK 的正向調控。

同時，本研究KEGG 富集分析也富集到了JAK-STAT 信號通路及T 輔助細胞17 細胞分化，JAK-STAT 通路與炎癥和自身免疫性疾病的發病機制有關［31］，包括胃潰瘍［32］。本文中，PPI 網絡中的核心靶點STAT3 是上述通路激活的主要轉錄因子之一［33-34］，對上述的T 輔助細胞17（能分泌關鍵細胞因子如IL-17 和IL-22 等［31］）的分化至關重要，有研究表明STAT3 在疾病的慢性炎癥期也存在過度表達［35］，主要通過多種蛋白酪氨酸激酶磷酸化激活［36-37］。研究表明，抑制STAT3 可隨后抑制COX-2 和一氧化氮合酶（iNOS）的表達來對抗幽門螺桿菌感染發揮抗炎作用。本次富集分析同樣提示酪氨酸基肽磷酸化、酪氨酸基肽的修正可能參與此過程。

3.3 康復新液通過細胞因子的正向調節治療胃潰瘍

胃潰瘍的愈合是一個細胞再生過程，受到細胞因子的調控，涉及到細胞增殖、遷移、表皮細胞再生、肉芽組織形成、血管生成及細胞和基質之間的相互用作等，其中生長因子在細胞增殖、遷移、表皮細胞再生等步驟起到關鍵作用［38］。本次研究中富集分析表明：細胞因子產生的正向調節是康復新液對胃潰瘍治療的關鍵機制之一。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學對康復新液治療胃潰瘍的潛在活性成分及潛在機制進行分析。根據PPI 互作網絡得出的關鍵靶點及GO、KEGG 富集分析得到的關鍵生物過程及信號通路進行綜合分析，提示康復新液對胃潰瘍的治療作用涉及了多種機制，其中以抗氧化應激反應及對JAK-STAT、PI3K-AKT 等信號通路為代表的炎癥反應調節最為顯著。但目前仍需進一步試驗證明上述結論。