斑馬魚(yú)MIB1啟動(dòng)子及互作基因的功能富集分析*

王 凡,徐世明,鄢 雯,古同男,王宏娟

首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,北京 101300

在蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中,泛素化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方式之一,底物與泛素可通過(guò)E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶催化的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)建立共價(jià)連接,進(jìn)而影響底物蛋白的活性[1]。E3泛素連接酶是泛素化反應(yīng)中的關(guān)鍵酶,介導(dǎo)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中底物的識(shí)別,確定泛素化反應(yīng)的特異性,并通過(guò)調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的泛素化過(guò)程參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理過(guò)程[2]。有研究表明,E3泛素連接酶可利用泛素-蛋白酶體系統(tǒng),調(diào)節(jié)腫瘤相應(yīng)基因啟動(dòng)子或抑制子,影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3-4]。目前已發(fā)現(xiàn)600余種E3泛素連接酶,其中E3泛素蛋白連接酶1(MIB1)可通過(guò)泛素化NOTCH蛋白受體正向調(diào)節(jié)信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)吞作用[5]。在人胚胎干細(xì)胞中,MIB1蛋白能催化八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)的泛素化,調(diào)控OCT4蛋白處于適宜的表達(dá)水平,并介導(dǎo)OCT4經(jīng)26S蛋白酶體途徑的降解,從而維持胚胎干細(xì)胞的自我更新[6]。此外,鈣黏著蛋白關(guān)聯(lián)蛋白可被MIB1蛋白泛素化進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞遷移[7],MIB1蛋白還可以調(diào)控胰腺向腺泡細(xì)胞或?qū)Ч芊只痆8]。

斑馬魚(yú)是模式脊椎動(dòng)物之一,其基因組與人類(lèi)基因相似度達(dá)到87%,數(shù)據(jù)庫(kù)中有其相關(guān)信息供查詢(xún)下載,可作為人類(lèi)疾病模型,其已成為生命科學(xué)研究的新寵[9]。本研究通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)MIB1基因的生物信息學(xué)研究,包括非編碼RNA(ncRNA)預(yù)測(cè)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)分析、互作基因與互作蛋白預(yù)測(cè),以及基因功能富集分析等,探究斑馬魚(yú)MIB1基因的相關(guān)功能。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 斑馬魚(yú)MIB1基因序列的獲取:美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。ncRNA預(yù)測(cè):國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(NGDC)(http://ngdc.cncb.ac.cn/lgc/calculator)。TATA盒預(yù)測(cè)網(wǎng)址:SoftBerry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)。TFBS預(yù)測(cè)網(wǎng)址:Alggen(http://alggen.lsi.upc.es),AnimalTFDB(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB4/#/)。互作基因預(yù)測(cè)網(wǎng)址:GeneMANIA(http://genemania.org)。基因本體(GO)與京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)分析數(shù)據(jù)來(lái)源:DAVID(https://david.ncifcrf.gov)。互作蛋白預(yù)測(cè)網(wǎng)址:STRING(http://cn.string-db.org)。

1.2方法

1.2.1斑馬魚(yú)MIB1基因及其啟動(dòng)子序列的獲取 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索斑馬魚(yú)MIB1基因,讀取相關(guān)基因信息,在“工具”下拉按鈕中選擇“序列文本視圖”,從中選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp內(nèi)的DNA序列,獲取MIB1基因的啟動(dòng)子序列。將MIB1基因啟動(dòng)子及5′非翻譯區(qū)的序列上傳至SoftBerry中,預(yù)測(cè)TATA盒。

1.2.2ncRNA的預(yù)測(cè) 登錄NGDC網(wǎng)站,在ncRNA模塊中將斑馬魚(yú)MIB1基因啟動(dòng)子及5′非翻譯區(qū)的序列一同輸入文本框進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3斑馬魚(yú)MIB1基因TFBS預(yù)測(cè) 登錄Alggen網(wǎng)站,點(diǎn)擊“啟動(dòng)子”按鈕,在“設(shè)置因子”與“設(shè)置位點(diǎn)”中均選擇“真核生物”。點(diǎn)擊“查詢(xún)位點(diǎn)”按鈕,上傳斑馬魚(yú)MIB1基因的啟動(dòng)子序列,設(shè)置“最大矩陣差異率”為0,點(diǎn)擊“提交”進(jìn)行預(yù)測(cè),該數(shù)據(jù)庫(kù)使用的是TRANSFAC 8.3版本。登錄AnimalTFDB網(wǎng)站,點(diǎn)擊“預(yù)測(cè)TFBS”,在對(duì)話框中輸入啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè),下載預(yù)測(cè)結(jié)果。該網(wǎng)站使用的是動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)4.0版本。綜合結(jié)果中的“得分”與“P值”,篩選“得分”≥16且“P值”≤10-6數(shù)量級(jí)的TFBS,將篩選結(jié)果與Alggen網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行合并整理。

1.2.4預(yù)測(cè)斑馬魚(yú)MIB1蛋白與其轉(zhuǎn)錄因子的作用關(guān)系 登錄STRING網(wǎng)站,選擇“多種蛋白質(zhì)”,將預(yù)測(cè)得到的TFBS與MIB1蛋白的名稱(chēng)共同輸至對(duì)話框中,物種選擇“斑馬魚(yú)”,點(diǎn)擊“搜索”進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5GeneMANIA預(yù)測(cè)斑馬魚(yú)MIB1的互作基因 登錄GeneMANIA網(wǎng)站,在主頁(yè)物種下拉菜單中選擇“斑馬魚(yú)”,并在右側(cè)對(duì)話框中輸入MIB1基因的名稱(chēng)進(jìn)行預(yù)測(cè),篩選具有相互作用關(guān)系或調(diào)節(jié)作用的基因信息,需要說(shuō)明的是該網(wǎng)站預(yù)測(cè)的信息更偏向GO功能。

1.2.6STRING預(yù)測(cè)斑馬魚(yú)MIB1的互作蛋白 登錄STRING網(wǎng)站,選擇“按蛋白序列”搜索,在對(duì)話框中輸入MIB1蛋白序列,同時(shí)在“生物”選項(xiàng)中選擇“斑馬魚(yú)”,點(diǎn)擊“搜索”。在彈出的網(wǎng)頁(yè)中選擇目的蛋白后,點(diǎn)擊“繼續(xù)”進(jìn)行預(yù)測(cè),再次通過(guò)輸入MIB1蛋白名稱(chēng)的方式進(jìn)行預(yù)測(cè),將兩次預(yù)測(cè)結(jié)果匯總。

1.2.7斑馬魚(yú)MIB1基因的GO與KEGG可視化分析 登錄DAVID網(wǎng)站,在“開(kāi)始分析”中,將預(yù)測(cè)得到的互作基因名稱(chēng)粘貼至“基因列表”中進(jìn)行富集,下載有關(guān)生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)及KEGG中的圖表數(shù)據(jù),利用 Fisher檢驗(yàn)得到P值后進(jìn)行GO與KEGG可視化分析,繪制直方圖與氣泡圖,并在KEGG富集的圖表數(shù)據(jù)中,點(diǎn)擊相應(yīng)鏈接,分析信號(hào)通路圖。

2 結(jié) 果

2.1斑馬魚(yú)MIB1基因及啟動(dòng)子序列特點(diǎn) 斑馬魚(yú)MIB1基因ID為352910,位于2號(hào)染色體,全長(zhǎng)87 102 bp,包含22個(gè)外顯子,其編碼序列共編碼1 040個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游53 bp處(即啟動(dòng)子序列第1 448 bp處)存在TATA盒。斑馬魚(yú)MIB1基因的5′非翻譯區(qū)長(zhǎng)度為1 001 nt。

2.2ncRNA預(yù)測(cè)結(jié)果 由于斑馬魚(yú)MIB1基因的5′非翻譯區(qū)較長(zhǎng),推測(cè)有編輯ncRNA的可能性,對(duì)此進(jìn)行了預(yù)測(cè)驗(yàn)證,見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示,“Coding Potential Score”得分為-0.28,“Coding Label”結(jié)果為ncRNA。綜合預(yù)測(cè)結(jié)果提示,MIB1基因的啟動(dòng)子區(qū)及5′非翻譯區(qū)可轉(zhuǎn)錄出ncRNA。

注:ORF Length為最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度;GC Content為最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框的GC堿基水平;Coding Potential Score中得分大于0為mRNA,小于0為ncRNA,等于0表示轉(zhuǎn)錄出mRNA或ncRNA的概率相等;Coding Label中“Coding”代表mRNA,“Noncoding”代表ncRNA,Pc為開(kāi)放閱讀框存在于編碼序列中的可能性,Pnc為開(kāi)放閱讀框存在于非編碼序列中的可能性。

2.3Alggen網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果 經(jīng)Alggen網(wǎng)站預(yù)測(cè),在斑馬魚(yú)MIB1基因啟動(dòng)子序列中得到86種TFBS,見(jiàn)圖2,圖中已標(biāo)出各種TFBS及對(duì)應(yīng)的位置,但有重復(fù)。通過(guò)手動(dòng)去重后得到76種TFBS,其中AML1、ATF-2、CRE-BP2、DFD、DOF2、EVE、FOXP3、GAGA FACTOR、GT-1、HOXD家族、Oct-B1、MNB1a、P53、POU家族、SXR:RXR-ALPHA等在啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)的頻率較高。

圖2 TFBS預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4AnimalTFDB預(yù)測(cè)結(jié)果 在斑馬魚(yú)MIB1基因啟動(dòng)子區(qū)TFBS預(yù)測(cè)結(jié)果中,包含每個(gè)TFBS的位置、得分、P值、Q值及相應(yīng)位點(diǎn)的序列信息,經(jīng)過(guò)篩選并去重后,得到50種TFBS。將該結(jié)果與Alggen預(yù)測(cè)結(jié)果合并去重后,得到ABF1、ATF、C/EBP、CREB、CUTL1、DBP、DFD、DMRT3、EVE、FOSL、GA-BF、GAGA factor、GATA、GR、HNF、HOX、HSF1、IRF、JUN、MYB2、NFATC1、NFATC2、NIT2、OCT-B1、P53、PBF、POU、RC2、SQUA、STAT2、TFIID、TGGCA-binding protein、TLL、TRP53、UNC-86、WT1 I、XBP-1、ZFP28、ZNF等共計(jì)121種TFBS。

2.5MIB1與轉(zhuǎn)錄因子的作用關(guān)系 P53是抑癌基因TP53的轉(zhuǎn)錄編碼蛋白,具有轉(zhuǎn)錄因子活性。通過(guò)STRING預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),斑馬魚(yú)MIB1蛋白只與其轉(zhuǎn)錄因子P53有互作關(guān)系,與其余轉(zhuǎn)錄因子間無(wú)互作關(guān)系。有趣的是,作為反式作用因子,P53不僅能與MIB1基因啟動(dòng)子結(jié)合,還可與MIB1蛋白相互作用。見(jiàn)圖3。

圖3 P53因子與MIB1的作用關(guān)系

2.6GeneMANIA預(yù)測(cè)結(jié)果 經(jīng)GenaMANIA預(yù)測(cè),共得到20種斑馬魚(yú)MIB1的互作基因:ABAT、ACTN2b、ACTN3a、ACTN4、ATP2b4、CSNK2b、CYT1L、DLA、DLC、DLD、EXOC1、EXOC3、FAM76b、HSPA8、LRPAP1、MIB2、TOMM20b、USO1、YAF2、YWHAQA。結(jié)果顯示,MIB1基因與ACTN2b、CSNK2b、HSPA8、DLA和DLD基因有共表達(dá)的關(guān)系,見(jiàn)圖4。經(jīng)GenaMANIA進(jìn)一步查詢(xún)還發(fā)現(xiàn),MIB1與DLG1基因有共表達(dá)的關(guān)系,DLG1又可與DLG4b共享蛋白結(jié)構(gòu)域。

圖4 MIB1互作基因的作用關(guān)系

2.7STRING預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)輸入斑馬魚(yú)MIB1蛋白序列的方式預(yù)測(cè)得到11種MIB1互作蛋白,結(jié)果見(jiàn)圖5A;再輸入MIB1蛋白名稱(chēng),進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖5B。將兩次預(yù)測(cè)結(jié)果匯總,得到以下20種互作蛋白:DLD、DLA、DLC、ENSDARP00000050857、NOTCH1a、JAG2b、NEURL1b、NEURL1ab、NEURL1aa、LOC566455、MIB、LOC556551、SHROOM4、ABHD3、SHROOM2a、STK3、GREB1Ⅰ、ATOH1b、FTR82、SHROOM1。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),SHROOM1蛋白分別可與SHROOM2a、SHROOM4、STK3共表達(dá),NOTCH1a與DLA可共表達(dá),見(jiàn)圖6。 但STRING與GeneMANIA的預(yù)測(cè)結(jié)果并不完全是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系,前者主要描述蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系,后者更偏向于基因間的互作關(guān)系,如共表達(dá)、遺傳相互作用和物理相互作用等。

注:圖A為MIB1蛋白序列預(yù)測(cè)結(jié)果;圖B為MIB1蛋白名稱(chēng)預(yù)測(cè)結(jié)果。

圖6 MIB1互作蛋白共表達(dá)關(guān)系

2.8斑馬魚(yú)MIB1互作基因GO與KEGG分析 通過(guò)對(duì)MIB1互作基因的GO分析,見(jiàn)圖7A,發(fā)現(xiàn)MIB1基因及其互作基因在BP方面具有調(diào)控細(xì)胞、組織、器官生長(zhǎng)分化、NOTCH信號(hào)通路及神經(jīng)元的發(fā)生發(fā)展等功能。在CC方面,MIB1基因主要在細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞膜、頂端連接復(fù)合體、細(xì)胞骨架和突觸后致密區(qū)等部位富集。在MF方面,具有結(jié)合NOTCH蛋白和PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白等功能。KEGG分析得到4條代謝途徑,見(jiàn)圖7B。

注:A為GO分析;B為KEGG分析。

2.9信號(hào)通路分析 除NOTCH蛋白本身,有兩種斑馬魚(yú)MIB1互作蛋白(DELTA和SETTATE)直接參與到NOTCH 信號(hào)通路中,見(jiàn)圖8,但是在前面的預(yù)測(cè)中并未發(fā)現(xiàn)MIB1與SERRATE有直接的互作關(guān)系。為此,通過(guò)GeneMANIA分析MIB1與SERRATE的作用關(guān)系發(fā)現(xiàn),SERRATE與剪切多聚腺苷酸化特異性因子(CPSF3)、DEAD盒解旋酶(DDX5)、非ATP 酶蛋白酶體26S亞基1(PSMD1)、復(fù)制蛋白A2(RPA2)、剪接因子3a(SF3a)具有共表達(dá)的關(guān)系,且MIB1與上述5種基因都具有物理相互作用關(guān)系,MIB1與SERRATE存在間接作用關(guān)系。

圖8 MIB1互作蛋白在NOTCH信號(hào)通路中的位置關(guān)系

3 討 論

ncRNA廣泛涉及不同水平的基因調(diào)控,與基因沉默和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控密切相關(guān),ncRNA的異常表達(dá)常與某些侵襲性病變有關(guān)[10]。經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),斑馬魚(yú)MIB1啟動(dòng)子區(qū)及5′非翻譯區(qū)可轉(zhuǎn)錄出ncRNA,而這些ncRNA的具體功能尚需進(jìn)一步探索。

斑馬魚(yú)MIB1基因的TFBS的預(yù)測(cè)結(jié)果中得到了121種TFBS,其中包含轉(zhuǎn)錄因子P53。P53發(fā)揮著監(jiān)控細(xì)胞分裂和影響細(xì)胞周期啟動(dòng)的作用。細(xì)胞出現(xiàn)損傷后,P53蛋白會(huì)阻止DNA復(fù)制,并對(duì)損傷DNA進(jìn)行修復(fù)。如果P53基因發(fā)生突變,會(huì)導(dǎo)致機(jī)體失去對(duì)細(xì)胞增殖的控制,引起細(xì)胞癌變[11]。分析預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),P53不僅是斑馬魚(yú)MIB1基因的轉(zhuǎn)錄因子之一,還可與MIB1蛋白相互作用,推測(cè)P53可通過(guò)這種雙重調(diào)控方式抑制MIB1在癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)[12]。這種方式在P53參與的基因表達(dá)調(diào)控中并不常見(jiàn),值得進(jìn)一步深入研究。通過(guò)預(yù)測(cè)還發(fā)現(xiàn),斑馬魚(yú)MIB1基因啟動(dòng)子區(qū)存在IRF 1～3的結(jié)合位點(diǎn)。而IRF家族成員是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,可結(jié)合到干擾素基因(IFN)啟動(dòng)子上,在機(jī)體受到病毒感染時(shí)IRF可調(diào)控IFN基因的表達(dá)[13]。據(jù)此推測(cè)斑馬魚(yú)MIB1基因在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮一定的作用。

GeneMANIA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,斑馬魚(yú)MIB1與MIB2存在互作關(guān)系,推測(cè)斑馬魚(yú)MIB1與MIB2應(yīng)是相互結(jié)合后,介導(dǎo)通路中信息的傳遞。此外,MIB1與HSPA8也存在互作關(guān)系。有研究稱(chēng),在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中,MIB1可被迅速滅活,導(dǎo)致AZI1、PCM1、CEP290非泛素化[14]。通過(guò)進(jìn)一步查詢(xún)發(fā)現(xiàn),MIB1還與HSPA5和HSPA9相互作用。在此過(guò)程中,推測(cè)MIB1的滅活應(yīng)該是由熱應(yīng)激蛋白介導(dǎo)的。此外,經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)MIB1還與DLG4b有間接作用關(guān)系。DLG4b基因的表達(dá)產(chǎn)物為突觸后致密區(qū)蛋白 95(PSD95),其對(duì)興奮性神經(jīng)元的突觸強(qiáng)度和可塑性至關(guān)重要,與突觸信號(hào)傳導(dǎo)、發(fā)育和生存密切相關(guān)[15]。筆者推測(cè)MIB1可能是通過(guò)PSD95的介導(dǎo),進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的。

STRING預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,MIB1有6種互作蛋白未在實(shí)驗(yàn)中證實(shí),包括ABHD3、GREB1l、LOC556551、SHROOM1、SHROOM2a與SHROOM4。在胚胎發(fā)育后期,SHROOM家族蛋白在上皮器官中廣泛表達(dá),可使上皮細(xì)胞被拉長(zhǎng),且SHROOM2的異位表達(dá)能夠增加細(xì)胞長(zhǎng)度,而SHROOM2功能缺陷則導(dǎo)致神經(jīng)上皮細(xì)胞伸長(zhǎng)失敗,SHROOM家族蛋白對(duì)于上皮組織的形態(tài)發(fā)生起著重要作用[16]。所以,筆者推測(cè)SHROOM家族蛋白可能通過(guò)介導(dǎo)MIB1影響細(xì)胞的形成分化,二者對(duì)于細(xì)胞分化及胚胎發(fā)育至關(guān)重要。

GO分析發(fā)現(xiàn),造血干細(xì)胞分化這一生物過(guò)程所涉及的基因有DLC、NOTCH1a、DLD和MIB1,推測(cè)MIB1基因與造血干細(xì)胞分化存在一定關(guān)系。在MF方面,富集到MIB1的互作蛋白(DLC、DLD)具有與PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合的功能。PDZ結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞運(yùn)輸、各種離子通道、細(xì)胞-細(xì)胞連接及細(xì)胞遷移關(guān)系密切,且對(duì)神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)、記憶和學(xué)習(xí)至關(guān)重要。鑒于其重要的生物學(xué)作用,PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白被用于開(kāi)發(fā)小分子抑制劑,可作為治療藥物的潛在靶點(diǎn)[17],推測(cè)MIB1可能由DLC或DLD介導(dǎo),與PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白發(fā)生間接作用,影響細(xì)胞進(jìn)程。

研究表明,MIB1蛋白介導(dǎo)DELTA受體的泛素化,其作為NOTCH蛋白的配體,通過(guò)泛素化DELTA胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,使DELTA受體發(fā)生內(nèi)吞作用,正向調(diào)控DELTA介導(dǎo)的NOTCH信號(hào)通路[18],而NOTCH信號(hào)通路與多種癌癥的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生有關(guān)[19]。MIB1還參與NOTCH信號(hào)通路調(diào)控的許多過(guò)程,如胚層的形成、耳中感覺(jué)細(xì)胞的分化、后腦的神經(jīng)發(fā)生、腸分泌和細(xì)胞遷移等,其對(duì)早期胚胎的發(fā)育至關(guān)重要[20]。信號(hào)通路分析結(jié)果表明,斑馬魚(yú)MIB1可能通過(guò)與SERRATE的間接作用,從而調(diào)節(jié)NOTCH信號(hào)途徑。

本研究從斑馬魚(yú)MIB1啟動(dòng)子、互作基因、互作蛋白和信號(hào)通路入手,由基因表達(dá)的上游至下游,系統(tǒng)地探討了MIB1的潛在生物學(xué)功能。隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展,基因功能的預(yù)測(cè)將更為精確,可為今后的研究提供更有價(jià)值的信息。