肝郁腎虛型不明原因復發性流產臨床表現與腸道菌群相關性研究＊

馮曉玲，涂許許

（1. 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫藥大學研究生院 哈爾濱 150040）

復發性流產（Recurrent spontaneous abortion，RSA）是一種常見的不良妊娠結局，影響約5%的女性。常見的病因有解剖學、染色體及內分泌異常、感染、環境污染、自身免疫機制等，但仍有約40%-50%的RSA 病因不明，稱不明原因復發性流產（Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[1]。RSA 屬中醫“滑胎”范疇，而肝郁腎虛型又為其常見證型，除腎虛證表現外，常伴煩躁易怒、心情抑郁等癥狀。針對RSA 患者負性情緒的研究也發現，RSA 患者相較健康女性更易出現壓力、抑郁等不良情緒[2]。近年來，隨著人們對精神心理疾病發病機制研究的進展，腸道微生物與大腦通過“腦-腸-微生物”軸雙向溝通的理論開始建立，腸道菌群的失調可能與URSA 的負性心理狀態存在一定聯系[3]，本研究通過分析未孕肝郁腎虛型URSA 患者腸道菌群特點及與臨床癥狀的聯系，為后續URSA 機制及治療研究提供新視角。

1 對象與方法

1.1 對象

研究對象均來自于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院婦科門診及住院部，收集時間為2020年9月-2021年1月。研究對象包含兩組：肝郁腎虛型未孕URSA患者28 人、健康未孕女性43 人，所有受試者均簽署知情同意書，本實驗經黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準

URSA診斷標準參照相關共識[4]制定：①12孕周內自然流產次數≥2；②夫婦雙方無遺傳性疾病，染色體正常；③生殖道解剖結構無異常；④內分泌正常；⑤排除自身免疫異常；⑥無支原體、衣原體及病毒等感染；⑦男方精液檢查正常。

1.2.2 中醫診斷標準

肝郁腎虛型滑胎的中醫診斷標準按照《中醫婦科學》[5]、《中醫病癥診斷療效標準》[6]制定。

（1）主癥：屢孕屢墮、如期而墮。

（2）次癥：①肝郁：胸脅、乳房、小腹脹滿或疼痛，胸悶不舒，煩躁易怒，心情抑郁；②腎虛：頭暈耳鳴，腰酸膝軟，夜尿頻，失眠健忘。

（3）舌脈：舌淡黯，苔薄黃或少苔，脈沉細弱或沉弦。

符合主癥及次癥中肝郁及腎虛癥狀各1 項及以上，結合舌脈即可診斷。

1.3 納入標準

①育齡期婦女，年齡20-40 歲；②1 個月內未服用過抗生素、微生態制劑；③簽署知情同意書；④所有組別均為漢族人群，地域無跨度差異；⑤URSA 肝郁腎虛組應同時符合西醫及中醫診斷標準；⑥健康對照組：有至少1次正常生育史，既往無不良孕產史。

1.4 排除標準

①患RSA有明確病因者；②合并其他疾病（如糖尿病、腫瘤、消化系統疾病、心、肝、腎、血液系統疾病及神經精神類疾病）；③入組前已服用藥物治療者；④伴有急慢性泌尿生殖系統感染者；⑤妊娠及哺乳期女性。

1.5 脫落標準

①患者自行退出；②研究者令其退出（依從性差、嚴重不良事件等）。

1.6 剔除標準

①收集數據不完整者；②糞便標本質檢不合格者。

2 研究方法

2.1 收集資料

①收集兩組受試者一般情況（姓名、年齡、身高、體重、民族、居住地）及孕產史、有無既往疾病、近3 個月飲食及服藥情況。②中醫證候積分采用中醫證候分級量化表進行記錄和評價，證候包括：胸脅、乳房、小腹脹滿或疼痛，胸悶不舒，煩躁易怒，心情抑郁，頭暈耳鳴，腰酸膝軟，夜尿頻，失眠健忘。按照無、輕、中、重分別計為0，1，2，3 分。③應用抑郁-焦慮-壓力量表（Depression Anxiety Stress Scales，DASS）簡體中文版量表評估URSA患者焦慮、抑郁、壓力情緒，共有42個選項，患者對每一項進行自評，打分等級從0分至3分，程度依次加重[7]。

2.2 樣本采集

收集兩組患者糞便樣本，取樣時間為6∶00-10∶00，將糞便排入采集盒或清潔的容器中，用無菌棉簽刮去表層糞便，用無菌采樣管中的取樣匙取清潔中段便約5 g，立即放入采樣管中并注明標本信息，于-80℃冰箱中儲存。

2.3 DNA提取與檢測

總DNA 的提取用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 試劑盒進行，DNA 提取質量使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA定量用紫外分光光度計完成。

2.4 PCR擴增

使用引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’），擴增V3-V4 區間序列，PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳確證。在DNA提取全過程中，陰性對照采用超純水以排除PCR結果假陽性的可能。

2.5 PCR純化、定量及測序

PCR 產物由AMPure XT beads 純化，Qubit 定量。擴增子池用于測序，擴增子文庫的大小和數量評估分別采用Agilent2100生物分析儀和Illumina 的文庫定量試劑盒完成。排序在NovaSeq PE250平臺進行。

2.6 數據處理

樣品在Illumina NovaSeq 平臺上按照制造商的建議進行測序。根據fqtrim（v0.94）進行質量過濾，使用Vsearch 軟件（v2.3.4）對嵌合序列進行過濾。利用DADA2進行解調，得到特征表和特征序列。多樣性通過歸一化到相同的隨機序列計算。

2.7 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件，應用獨立樣本T檢驗，分析兩組年齡差異。Alpha 及Beta 多樣性用QIIME2 計算。采用Blast 進行序列比對，SILVA 數據庫對特征序列進行注釋。應用Spearman分析豐度前30的菌群與年齡、流產次數及臨床指標間關系。采用R 包（v3.5.2）實現圖形的繪制。

3 結果

3.1 年齡分布

肝郁腎虛組平均年齡32.71±3.15歲，正常組平均年齡31.51±2.73歲，兩組年齡間無統計學差異（見表1）。

表1 肝郁腎虛組與正常對照組年齡對比

3.2 Alpha及Beta多樣性分析

Alpha 多樣性體現了一個生態環境中生物的類群數量（豐富度）及相對豐富程度（均勻性），通過分析肝郁腎虛組與對照組Alpha 多樣性結果，兩組在各指數均未觀察到顯著差異（P≥0.05，見圖1）

圖1 Alpha多樣性分析的小提琴圖

Beta 多樣性指數用于比較不同群落中生物群落的多樣性水平，通過分析多樣性距離關系和生物群落之間分化程度，可以較好反映兩個組樣本間物種差異，PCoA中，未加權UniFrac距離強調了由于群落組成差異而導致的樣本間的差異，而加權UniFrac 距離則更強調了不同群落物種豐度梯度的變化，結果表明兩組菌群存在顯著性差異（P<0.05，見圖2）。

圖2 Beta多樣性分析的PCoA圖

3.3 物種分析

柱狀圖顯示了門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）在兩組中占比最大，肝郁腎虛組中擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）占比依次位于2、3、4 位，與健康對照組中放線菌門多于擬桿菌門的表現不同（圖3A）。屬水平上，肝郁腎虛組含量前5的菌依次為：普氏糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、巨單胞菌屬（Megamonas）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、普雷沃菌屬（Prevotella_9），而對照組為：Bifidobacterium、Faecalibacterium、Bacteroides、Megamonas、Agathobacter（圖3B）。

圖3 物種分析示意圖

對相對豐度最高的30 個樣本數據聚類后排序生成熱圖，顏色條上的值是由相應顏色指示的兩組樣本在門、屬水平上的相對豐度（圖3C、3D）。

桑基圖直觀體現了兩組在門、屬水平上對應的物種相對豐度及比例（見圖3E）。

3.4 差異分析（LDA effect size，LEfSe）

通過Kruskal-Wallis 秩和檢驗找到豐度差異類群，Wilcoxon 秩和檢驗判斷得到的所有亞種是否趨于同一分類級別；LDA（線性判別分析）評估每個組分豐度對差異效果的影響大小，并繪制圖形。圖4A 中圓圈的大小與分類單元的豐度成正比。紅色表示正常對照組，綠色為肝郁腎虛組，黃色為差異不顯著，圖4B中條形圖展示了兩組有顯著差異菌屬的LDA值。

圖4 LEfSe分析示意圖

3.5 菌群與臨床指標間的聯系

應用Spearman分析LEfSe分析中兩組差異菌群與年齡、流產次數、中醫證候評分、DASS-焦慮（Anxiety）、DASS-抑郁（Depression）、DASS-壓力（Stress）、DASS-總分間的關系，紅色及藍色如圖例顯示代表正、負相關，顏色越深，相關性水平越高，有統計學意義的項目以星號標注，結果如圖5、6、表2、3。

圖5 年齡、流產次數、中醫證候評分、DASS評分與GYSX組優勢菌群間相關性分析熱圖

圖6 年齡、流產次數、中醫證候評分、DASS評分與正常組優勢菌群間相關性分析熱圖

表2 與各指標有顯著關聯的GYSX組優勢菌種

表3 與各指標有顯著關聯的正常組優勢菌種

4 討論

URSA 與中醫理論中“滑胎”、“數墮胎”含義相同，論至婦科妊娠病，病機一定以沖任損傷為要，從婦科基本理論看，肝氣郁結，疏泄功能失常，可致胞宮藏瀉無度，或肝郁化火，熱傷沖任，或妊娠血聚于下養胎，肝血不足，沖任經脈血虛，不能充養胞宮，抑或素性抑郁、情志過急，導致氣分病變，影響沖任、胞宮功能，導致屢次墮胎。墮胎的發生損傷腎氣，而滑胎患者屢孕屢墮，腎氣益虛，而易因胎元不足而墮胎，形成惡性循環，病情遷延，久病傷絡。加之部分患者素稟腎氣虛弱，天癸不能充盈，胞宮本就虧虛，更易發生腎虛所致的滑胎。從肝腎的關系看，肝腎同源，肝血與腎精可互相化生滋養，但肝郁腎虛中，肝血化源不足，腎精亦不得滋養，而滑胎的反復發病，不僅加重情志異常，亦耗傷腎氣，加重病情。且肝腎藏泄互用，腎精虧虛，源本不足，肝亦失于疏泄，使腎精更難化生天癸而濟于沖任以養胞系胞。

對兩組各105例社會人口狀況相似的健康女性及RSA 患者的研究發現，RSA 女性的焦慮、抑郁程度明顯更高[8]，另一項訪談則顯示了RSA 患者及其伴侶的壓力和疲勞隨流產次數的增加而加重[9]。壓力、抑郁和焦慮是高度共病的狀態，具有重疊的生物學機制和表現，都被歸類為應變穩態（Allostasis）失衡，通過腸道微生物群-大腦軸與腸道微生物相互作用[10]。

微生物群的失調不僅影響宿主腸道內環境的免疫，還可導致粘膜或全身免疫紊亂，而導致慢性炎癥[11]，而以輔助性T細胞（Helper T cell，Th）17及Th1占優勢的免疫炎性狀態是URSA免疫異常的重要機制[12-13]。高脂飲食誘導小鼠含脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的腸道微生物群比例增加，LPS 是炎癥的誘發因子，LPS 與其受體白細胞分化抗原（Cluster of differentiation，CD）14形成復合物，并被免疫細胞表面Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）4 識別，誘導機體發生非特異性慢性低度炎癥[14]。腸道菌群還可增加腸黏膜通透性，升高LPS水平，導致炎癥因子大量生成[15]。

在本研究中，Alpha 多樣性未觀察到顯著差異，但Beta 多樣性存在差異，因相較于Beta 多樣性，Alpha 多樣性更多的是反映群體內部的分布情況，而不是群體物種間的差異，故此結果可說明未孕肝郁腎虛型URSA患者腸道菌群與健康未孕女性不同。

具體而言，肝郁腎虛患者門水平上擬桿菌門（Bacteroidetes）及變形菌門（Proteobacteria）顯著高于正常組，而放線菌門（Actinobacteria）水平則較正常組低。擬桿菌產生大量的LPS，抑制擬桿菌等產生LPS的細菌的生長可以保護腸道屏障功能，降低宿主炎癥水平[16]。變形桿菌具有致病代表性，如腸桿菌屬，可在特定環境中引起感染和疾病[17]。放線菌門則主要包含有益菌——雙歧桿菌，其正面效應包括維持腸道屏障內穩態、促進糖類代謝、促進免疫系統發育并調節免疫反應等[18]。

LefSe 分析提示，URSA 中擬桿菌門-普雷沃菌屬（Prevotella_2）為標志性物種，有研究發現普氏菌豐度的增加與炎癥疾病有關，一些菌株表現出致病特性[19]，且普雷沃菌誘導小鼠結腸中Th17細胞的產生[20]。而放線菌門-雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）為正常組中優勢菌，雙歧桿菌的減少與腸道通透性的增強有關，從而導致LPS轉運到血清中，觸發免疫系統激活并維持慢性炎癥[21]。本研究分析了兩組差異菌群與年齡、流產次數、DASS評分、中醫證候評分間的聯系。在正常組與中醫證候評分呈負相關的菌群中，雙歧桿菌數量的下降可使腸道通透性增強，LPS觸發免疫反應導致慢性炎癥[21]，其余菌屬目前未發現與URSA發病機制相關的聯系。

綜上所述，本研究發現未孕肝郁腎虛型URSA 患者與正常健康女性腸道菌群構成存在差異，且患者中醫證候評分與腸道菌群存在聯系。后期將擴大樣本量，并針對其他證型及中醫藥改善腸道菌群與治療URSA間進行進一步研究。