不同海拔栽培附子的毒性指標和藥效指標比較分析

摘要：為了解云南不同海拔栽培附子與道地產區出產附子的品質差異，以云南西北地區9個不同海拔栽培的附子為試材，以四川江油附子為對比樣，參照《中華人民共和國藥典》，采用高效液相色譜法（HPLC）對附子樣品中的3種毒性檢測指標物（新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿）和3種藥效檢測指標物（苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿）進行含量分析。結果表明，云南9個高海拔試驗田種植的附子毒性檢測指標物含量明顯低于四川江油對比樣、藥效檢測指標物含量明顯高于四川江油對比樣；且在海拔為2169 m的云南迪慶藏族自治州維西縣永春鄉拖枝村等地，附子的毒性檢測指標物含量較低，接近藥典規定的毒性指標，藥效檢測指標物含量遠高于藥典規定的藥效指標。此發現，可為利用海拔優勢推廣種植高效低毒附子的栽培研究提供參考，為當地布局優勢產業提供理論依據。

關鍵詞：附子；海拔；生物堿；毒性檢測指標；藥效檢測指標

中圖分類號：R286.0 文獻標志碼：A

Comparative Analysis of Toxicity and Efficacy Indicators of Radix Aconiti Lateralis Preparata Cultivated at Different Altitudes

ZHANG Meihua1， TAN Yiwei1， LI Weiqiang1， HUANG Qianying1，

WU Genghuan1， XU Tiancai2*

（1Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China； 2The Alpine Economic Plant" " "Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Lijiang， Yunnan 674100， China）

Abstract： In order to understand differences in quality of Aconiti Lateralis Radix Preparata （Fuzi） cultivated at different altitudes in Yunnan Province and those produced in original areas， the Fuzi cultivated at 9 different altitudes in northwest of Yunnan Province were used as the test materials， while the ones collected from Jiangyou， Sichuan as the contrast， and high-performance liquid chromatography （HPLC） was used to analyze content of 3 substances for toxicity detection （mesaconitine， hypaconitine， aconitine） and 3 substances for efficacy detection （benzoylmesaconine， benzoylhypacoitine and benzoylaconine） in accordance with Chinese Pharmacopoeia. Results showed that content of the substances for toxicity detection of Fuzi grown in 9 high-altitude experimental fields in Yunnan were significantly lower than that of the contrast， and content of the substances for efficacy detection were significantly higher than that of the contrast; moreover， in areas high at 2169 m， the content of the substances for toxicity detection of Fuzi grown in Tuozhi Village， Yongchun Town， Weixi County， Dêqên Tibetan Autonomous Prefecture， Yunnan Province was lower， close to the toxicity standard specified in the pharmacopoeia， and the content of substances for efficacy detection was far higher than the efficacy indicators specified in the pharmacopoeia. This discovery could provide references for cultivation of Fuzi of high efficacy and low toxicity by making full use of altitude， and provide theoretical bases for layout design of advantaged industries in the local.

Key words： Fuzi; altitude; alkaloid; toxicity detection indicator; efficacy detection indicator

附子為毛莨科烏頭屬烏頭（Aconitum carmichaeli Debx.）植物旁生塊根，能補火助陽、散寒止痛，有“回陽救逆第一品藥”之稱，被譽為“藥中良將”，但亦有大毒，在《神農本草經》中被列為下品藥[1-3]，在美國、英國、馬來西亞等國家屬于禁止出售藥品[4]。附子大效大毒的主要原因是其所含的生物堿，尤其是當中的雙酯型生物堿毒性最強，雙酯型生物堿新烏頭堿（C33H45NO11）、次烏頭堿（C33H45NO10）、烏頭堿（C34H47NO11）（以下簡稱3種雙酯型生物堿）是歷版《中華人民共和國藥典》關于附子的毒性檢測指標物，而單酯型生物堿苯甲酰新烏頭原堿（C31H43NO10）、苯甲酰次烏頭原堿（C31H43NO9）和苯甲酰烏頭原堿（C32H45NO10）（以下簡稱3種單酯型生物堿）則是藥典中關于附子的藥效檢測指標物［1-5］。不同產地附子的6種生物堿（3種雙酯型生物堿和3種單酯型生物堿）含量存在差異[5-7]，此6種生物堿也是區分不同產地附子的關鍵檢測指標物[8-11]。

四川江油是我國附子的道地性藥材最佳產地[12]。由于城市化建設，江油附子種植區域不斷減少，進而陸續開辟了諸多新興產區。從20世紀80年代起，附子的栽培產區由原低海拔種植區如江油（海拔450～600 m）向高海拔產區如云南西部（海拔1800～3500 m）開辟。但高海拔地區的生態環境、種植周期等方面明顯不同于低海拔[13]，故不同海拔栽培的附子品質差異如何，能否等同替代使用，是亟需回答的問題。目前國內外針對不同海拔梯度差異對附子毒性檢測指標物和藥效檢測指標物含量影響的研究鮮見報道，為了解不同海拔梯度對附子毒性檢測指標物和藥效檢測指標物含量的影響，本研究依托云南西北地區的海拔優勢，在9個不同海拔的附子試驗田進行取樣，對附子的毒性檢測指標物和藥效檢測指標物含量即6種生物堿含量進行測量，并將其與四川江油附子進行對比分析，為利用海拔優勢推廣種植高效低毒附子以及高效無毒附子的栽培研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

在云南西北地區選取不同海拔的9個栽培試驗區，并在附子最佳道地產區四川江油設置1處試驗對照區，共10個試驗區，詳細信息如表1所示。每個試驗區面積約為2700 m2。試驗區A1～A9多年平均氣溫為11.3～17.0℃，空氣相對濕度52.00%～72.26%，年平均降水量為800～1200 mm；土壤為 沙壤土、黃土；試驗田選擇地勢高，陽光充足，土壤疏松肥沃，土壤耕層為20～30 cm的地塊。江油試驗區CK耕作土層厚度為20～30 cm，土壤耕作層有機質含量≥1.3%，pH值6至8，年平均氣溫為15.9℃，降水量1113.21 mm，相對濕度81%，日照時數1277.1 h，雨熱同步，能保障對農作物的生長，適合附子的生長。

1.2 試驗材料

10個試驗區在附子種植過程中，只在播種前施用農家肥，并且在翌年的4月（四川江油試驗區）、6月（云南西北地區試驗區）追肥一次，不修根、不打頂，等到附子葉片變黃脫落時，開始采收取樣。按照五點法取樣，保證樣品的均衡性與代表性，每個試驗區共取樣50株附子。對樣品進行清洗、干燥，用粉碎機粉碎過3號篩混合均勻后備用。

1.3 儀器與試劑

Shimadzu LC-2010A-HT 系列自動液相色譜儀（島津，日本）；Sedex 80 ELSD 蒸發光散射器（Sedere，法國）；超聲儀（上海昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ5200B）；旋轉蒸發儀（上海青浦滬西儀器廠，型號：XTP-7000）；藥材粉碎機（上海鼎廣機械設備有限公司，型號：DFY-500）；MettlerToledo 電子天平（梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司，型號：AL104；乙腈、二氯甲烷、甲醇（美國 MREDA 公司，色譜純）；提取用的甲醇為分析純；純凈水；雙酯型生物堿對照品——新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿，單酯型生物堿對照品——苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿購于北京盈譯納新化工技術研究院。

1.4 試驗方法

本試驗方法參照《中華人民共和國藥典》［1］中關于附子藥理性檢測標準實施，分別對附子的毒性檢測指標物即3種雙酯型生物堿新烏頭堿（C33H45NO11）、次烏頭堿（C33H45NO10）、烏頭堿（C34H47NO11）的成分含量和藥效檢測指標物即3種單酯型生物堿苯甲酰新烏頭原堿（C31H43NO10）、苯甲酰次烏頭原堿 （C31H43NO9）和苯甲酰烏頭原堿（C32H45NO10）的成分含量進行測量分析。

1.4.1 對照品溶液的制備

（1）制備雙酯型生物堿對照品溶液。在Mettler Toledo 電子天平上分別稱取對照品：新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿各10.0 mg，然后分別加異丙醇與二氯甲烷（1∶1）混合溶液定容至25 mL，最后分別各取2.5 mL定容至100 mL，即得每1 mL各含10 μg的混合溶液，作為對照品溶液（雙酯型生物堿）。

（2）制備單酯型生物堿對照品溶液。在Mettler Toledo 電子天平上分別稱取對照品：苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿各10.0 mg，然后分別加異丙醇－二氯甲烷（1∶1）混合溶液定容至25 mL，最后分別取2.5 mL定容至100 mL，即得每1 mL各含10 μg的混合溶液，作為對照品溶液（單酯型生物堿）。

1.4.2 樣品溶液的制備

取日曬干燥的生附子在低溫粉碎機粉碎，粉末過3號篩，精密稱定2 g，置于塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇與乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理：功率300 W，頻率40 kHz，水溫在25 ℃以下30 min放冷，再稱定重量，用異丙醇與乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇與二氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，濾過，取續濾液，即得。樣品設3次重復。

1.4.3 色譜條件

色譜條件 Discovery C18柱（4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm）；柱溫35 ℃；流動相A相為乙腈與四氫呋喃（25∶15）混合溶液，B相為0.1 mol·L-1醋酸銨溶液（每1000 mL加0.5 mL冰醋酸），梯度洗脫，0～40 min，85%～80% A，40～50 min，80% A，流速1 mL·min-1，檢測波長235 nm。

1.4.4 附子生物堿的含量測定

按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液與樣品溶液10 μL注入液相色譜儀，測得樣品質量濃度，根據公式計算附子中毒性檢測指標物和藥效檢測指標物的含量，即6種生物堿（新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿）的含量。

1.5 數據處理

采用Excel" 2010處理數據，SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan法進行多重比較，Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 不同海拔附子毒性檢測指標物含量差異

由圖1可知，10個不同海拔試驗區栽培的附子毒性檢測指標物含量即3種雙酯型生物堿總量各不相同，且云南西北部9個試驗區所產種植的附子中3種雙酯型生物堿總量（0.0319%～0.0747% ）明顯低于四川江油試驗區附子中3種雙酯型生物堿總量（0.1599%～0.1602%），與《中華人民共和國藥典》（二部）[1]規定的附子中3種雙酯型生物堿總量計不得過0.020%很接近。本試驗測得的四川江油所產附子中3種雙酯型生物堿總含量與岳聰慧[14]關于附子不同栽培產區質量的比較研究中測得的四川江油附子中3種雙酯型生物堿總量0.1584%相符。由此可見，云南西北高海拔地區種植的附子毒性相對較低，均明顯低于四川江油種植附子。

2.2 不同海拔附子的藥效檢測指標物含量差異

由圖2可知，不同海拔試驗區的附子藥效檢測指標物含量即3種單酯型生物堿總量各不相同，尤其是云南西北地區的9個試驗區的附子3種單酯型生物堿總量（0.0547%～0.1713%）遠高于附子道地產區四川江油的附子3種單酯型生物堿總量（0.0214%～0.0217%），更遠高于《中華人民共和國藥典》（二部）[1]規定的附子中單酯型生物堿苯甲酰新烏頭原堿（C31H43NO10）、苯甲酰次烏頭原堿（C31H43NO9）和苯甲酰烏頭原堿（C32H45NO10）總量不得少于0.010%的指標。由此可見，云南西北高海拔地區種植的附子藥效檢測指標物含量均高于四川江油道地產區的附子，更遠高于藥典規定的藥效指標。

3 結論與討論

3.1 不同海拔附子的毒性檢測指標物和藥效檢測指標物含量存在差異，存在優勢種植區

由圖1、圖2可知，不同試驗區附子的毒性檢測指標物和藥效檢測指標物含量即6種生物堿含量各不相同，且無明顯的變化規律。但云南西北地區9個不同海拔試驗區附子的毒性檢測指標物均低于四川江油試驗區，藥效檢測指標物含量即3種單酯型生物堿總量均高于四川江油試驗區。由此可見，云南西北地區高海拔種植的附子毒性檢測指標物和藥效檢測指標物含量均優于四川江油試驗區。尤其在海拔為1831 m的迪慶藏族自治州香格里拉市開發區禮仁村魯禮村（A1）、海拔為2169 m的迪慶藏族自治州維西縣永春鄉拖枝村（A2）、海拔為2602m的迪慶藏族自治州德欽縣拖頂鄉閣加尼拉段（A5）3個試驗區的附子毒性較低、藥效較高，可作為附子的優勢種植區進行附子的推廣種植。

3.2 不同海拔栽培的附子毒性檢測指標物和藥效檢測指標物含量不同的原因有待探討

研究表明，不同海拔試驗區栽培的附子毒性檢測指標物和藥效檢測指標物含量各不相同，但無明顯的變化規律。這可能與附子根際土壤環境、小環境氣候條件、大田管理等諸多因素有關[15-17]，具體原因有待進一步研究。

3.3 高效低毒附子的炮制和高效無毒附子的研發

如何根據不同的毒性檢測指標物含量來選擇低毒高效原料，優化高效低毒附子的炮制方法及改良炮制工藝，以達到節本增效，值得進一步探討。

另外，雖然迪慶藏族自治州維西縣永春鄉拖枝村等地栽培的附子毒性檢測指標物含量遠低于四川江油道地附子，但與《中華人民共和國藥典》（二部）[1]規定的不得過0.020%還存在一定差距，如何栽培出符合《中華人民共和國藥典》[1]規定的安全有效、無需炮制的附子，有待進一步研究。

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責任編輯：李菊馨