人富血小板血漿來源外泌體促進體外培養施萬細胞的增殖

摘要：目的 探究人富血小板血漿來源外泌體（PRP-exos）對體外培養的施萬細胞（SC）增殖能力的影響。方法 采用聚合沉淀結合超速離心法提取PRP-exos，透射電鏡觀察其形態，納米顆粒跟蹤分析技術測定其濃度及粒徑分布，Western blot檢測外泌體表面標志蛋白CD63、CD81、CD9及血小板膜糖蛋白CD41。分離培養大鼠SC，免疫熒光染色檢測SC標記分子S100β的表達。熒光標記PRP-exos，與SC體外共培養，觀察兩者的相互作用。EdU實驗檢測PRP-exos對SC增殖能力的影響，CCK-8法檢測不同濃度（0、10、20、40、80、160 μg/ml）PRP-exos對SC增殖能力的影響。結果 提取的PRP-exos呈均勻的圓形囊泡，具有外泌體典型的茶托狀形態，平均粒徑（122.8±38.7）nm，濃度為3.5×1012個/ml，PRP-exos表面高表達CD63、CD81、CD9及CD41（Plt;0.001，P=0.025，P=0.004，P=0.032）。分離培養的SC表達S100β，PRP-exos可被SC攝取。濃度為40、80、160 μg/ml的PRP-exos可促進SC的增殖，且40 μg/ml PRP-exos的促增殖效果最佳（P均＜0.01）。結論 PRP中可提取較高濃度的PRP-exos，體外培養條件下，PRP-exos能夠被SC攝取，且對SC具有促增殖作用。

關鍵詞：富血小板血漿；外泌體；施萬細胞；增殖；神經再生

中圖分類號： R459.9；R741.05" 文獻標志碼： A" 文章編號：1000-503X（2023）03-0374-08

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15332

Human Platelet-Rich Plasma-Derived Exosomes Promote the Proliferation of Schwann Cells Cultured in Vitro

YI Dan1，2，ZHANG Yongyi1，3，JIANG Wenli2，LI Molin1，2，CHEN Xianghui1，2，YU Jiang1，YI Hongyu1，ZHU Yaqiong2，WANG Yuexiang2

1Medical School of Chinese PLA，Beijing 100853，China

2Department of Ultrasound，the First Medical Centre，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

3Department of Rehabilitation Medicine，the Second Medical Centre，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

Corresponding author：WANG Yuexiang Tel：010-66935455，E-mail：wangyuexiang1999@sina.com

ABSTRACT：Objective To investigate the effect of human platelet-rich plasma-derived exosomes（PRP-exos）on the proliferation of Schwann cell（SC）cultured in vitro.Methods PRP-exos were extracted by polymerization-precipitation combined with ultracentrifugation.The morphology of PRP-exos was observed by transmission electron microscopy，and the concentration and particle size distribution of PRP-exos were determined by nanoparticle tracking analysis.Western blotting was employed to determine the expression of the marker proteins CD63，CD81，and CD9 on exosome surface and the platelet membrane glycoprotein CD41.The SCs of rats were isolated and cultured，and the expression of the SC marker S100β was detected by immunofluorescence staining.The fluorescently labeled PRP-exos were co-cultured with SCs in vitro for observation of their interaction.EdU assay was employed to detect the effect of PRP-exos on SC proliferation，and CCK-8 assay to detect the effects of PRP-exos at different concentrations（0，10，20，40，80，and 160 μg/ml）on SC proliferation.Results The extracted PRP-exos appeared as uniform saucer-shaped vesicles with the average particle size of（122.8±38.7）nm and the concentration of 3.5×1012 particles/ml.CD63，CD81，CD9，and CD41 were highly expressed on PRP-exos surface（Plt;0.001，P=0.025，P=0.004，and P=0.032）.The isolated SCs expressed S100β，and PRP-exos could be taken up by SCs.PRP-exos of 40，80，and 160 μg/ml promoted the proliferation of SCs，and that of 40 μg/ml showed the best performance（all Plt;0.01）.Conclusions High concentrations of PRP-exos can be extracted from PRP.PRP-exos can be taken up by SCs and promote the proliferation of SCs cultured in vitro.

Key words：platelet-rich plasma；exosomes；Schwann cell；proliferation；nerve regeneration

Acta Acad Med Sin，2023，45（3）：374-381

富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是新鮮全血經過多次離心后獲得的多功能血小板濃聚物，其血小板濃度為生理濃度的3～6倍［1］。PRP中高濃度的血小板激活后可釋放多種生長因子，如血小板源性生長因子、血管內皮生長因子、轉化生長因子-β及表皮生長因子等［2］，臨床上用于促進組織的修復再生已近20年［3］。目前認為，PRP促再生潛能主要在于這些高濃度的生長因子協同作用于損傷局部的修復細胞，促進其增殖分化及細胞外基質合成，從而促進組織的再生修復。最新研究發現，PRP激活后除釋放大量的生長因子外，還釋放大量外泌體，共同參與組織修復的調控［4］。外泌體是體內各種細胞分泌的直徑為40～160 nm的雙層脂質膜囊泡［5］，具有較高的穩定性和極低的免疫原性，可保護其內容物免受生物酶降解以及逃避免疫系統的清除，是細胞間通信及物質傳遞的重要載體［6］。據文獻報道，PRP釋放的外泌體數量占外周血外泌體總數的70%以上［7］。進一步研究發現，相同體積的PRP來源外泌體（PRP-derived exosome，PRP-exos）相較于PRP含有更高濃度的生物活性因子，如生長因子、細胞因子及核酸等［8］。可見，PRP-exos在組織修復再生中具有巨大的治療潛能。

周圍神經損傷后的再生不良是神經科學面臨的嚴峻挑戰之一。施萬細胞（Schwann cell，SC）作為周圍神經系統重要的膠質細胞，在周圍神經修復再生過程中發揮關鍵作用。周圍神經損傷后，損傷處的SC通過去分化、增殖、趨化巨噬細胞、分泌多種生長因子、建立軸突再生通道（Bungner帶）、形成新生髓鞘等一系列精細復雜的調控作用參與損傷神經再生修復的整個過程［9-10］。可見，維持SC的數量及增殖能力是SC促再生功能發揮的基礎。近年來，一些研究發現各種類型干細胞分泌的外泌體可在一定程度上提高SC的增殖能力［11-12］，但干細胞外泌體常常受到來源有限、體外培養條件高以及干細胞衰老等限制，臨床轉化存在困難。而PRP采集流程成熟規范，外泌體含量高，這使PRP-exos能夠彌補干細胞外泌體的不足，極具研究價值，然而，目前關于PRP-exos對SC增殖影響的研究報道較少。因此，本研究擬通過探究PRP-exos體外共培養條件下是否具有促進SC增殖的作用，評估PRP-exos應用于神經再生修復方面的潛力，為后續研究奠定基礎。

材料和方法

材料 新生（2～3 d）SD大鼠10只購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。ExoQuick試劑盒購自美國System Biosciences公司，Ⅰ型膠原酶和Click-iT Plus EdU細胞增殖試劑盒購自美國Invitrogen公司，小鼠源Anti-CD9、Anti-CD63、Anti-CD81、Anti-CD41一抗和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗均購自美國Proteintech公司，兔源Anti-S100β抗體和Alexa Fluor 594山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司，毛喉素購自美國Sigma-Aldrich公司，表皮生長因子-D購自美國Ramp;D Systems公司，DAPI、DiO熒光染料和抗熒光淬滅封片劑均購自上海碧云天生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自北京百瑞極生物科技有限公司。本研究通過中國人民解放軍總醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批編號：S2022-230-01）。

PRP制備 5名健康志愿者簽署知情同意書后采集全血（50 ml/人），與檸檬酸右旋糖溶液A按照9∶1的體積比輕輕混勻。采用兩步離心法獲取PRP：首次離心（160×g，10 min）去除最底層的紅細胞和白細胞，將富含血小板的上清液移至新的離心管；第2次離心（250×g，15 min）棄掉上2/3貧血小板血漿，下1/3血小板沉淀重懸于剩余血漿中即獲得PRP［13-14］，儲存于-80 ℃冰箱。

PRP-exos提取 采用ExoQuick試劑盒，通過聚合沉淀結合超速離心法提取PRP-exos。首先用凝血酶（611 U/ml）對PRP進行預處理以去除PRP中的纖維蛋白原：將PRP與凝血酶按125∶1的比例混合均勻，4 ℃離心（10 000×g）5 min，去除底部的纖維蛋白沉淀，將上清液移至新的無菌離心管后，再次4 ℃離心（3 000×g）15 min去除細胞碎片。隨后加入外泌體提取工作液（樣本∶試劑=250∶63），4 ℃孵育30 min以沉淀外泌體，再次4 ℃離心（3 000×g）30 min，離心管底部的米白色沉淀即為PRP-exos。為進一步純化PRP-exos除去脂蛋白，用PBS重懸PRP-exos沉淀后，采用直徑為0.22 μm的無菌濾器進行過濾，隨后進行4 ℃超速離心（100 000×g）70 min，棄去上清液，得到的PRP-exos沉淀儲存于-80 ℃冰箱。

透射電鏡觀察PRP-exos形態 取出儲存PRP-exos的凍存管，復溫15 min后，加入PBS進行重懸。取10 μl外泌體懸液滴加于銅網上沉淀1 min，用濾紙沿銅網邊緣吸干多余液體，將10 μl醋酸雙氧鈾溶液滴加于銅網上外泌體沉淀處，靜置染色1 min，用濾紙吸去多余液體，常溫干燥3～5 min，采用透射電鏡在100 kV的加速電壓下觀察PRP-exos形態。

納米顆粒跟蹤分析檢測PRP-exos濃度與粒徑分布 采用ZetaView顆粒電位滴定及納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體的濃度與粒徑分布。將PRP-exos用PBS重懸后，按照1∶50的比例稀釋，取1 ml加入儀器樣本檢測池中，利用激光光源照射外泌體顆粒懸液，通過統計散射顆粒的數量來計算外泌體的濃度。同時，追蹤外泌體顆粒的布朗運動軌跡，計算單位時間間隔下外泌體顆粒的均方位移，通過Stokes-Einstein方程推算納米顆粒的粒徑分布。

Western blot檢測PRP-exos的表面標志蛋白 向PRP-exos沉淀和凝血酶激活后的PRP中加入RIPA裂解液，超聲下進行裂解，取上清液。采用BCA試劑盒對PRP-exos及PRP分別進行蛋白濃度定量。通過SDS-PAGE電泳進行蛋白分離，采用Bio-Rad轉膜儀，將蛋白由凝膠轉移至NC膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分次加入一抗CD9（1∶1 000）、CD63（1∶5 000）、CD81（1∶5 000）及CD41（1∶4 000），4 ℃孵育過夜。孵育后TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h。TBST洗滌后，加入ECL化學發光試劑進行顯影。采用Image J軟件進行條帶灰度定量分析。

SC提取與培養 選取出生2～3 d的SD大鼠乳鼠，浸入含75%酒精的缸內15 min，消毒處死。在顯微鏡下分離坐骨神經，置于預冷后的D-hanks液中，剝離神經外膜及神經束膜，用眼科剪將坐骨神經組織剪碎至1 mm3小塊。加入消化酶（0.25%胰蛋白酶和0.03% Ⅰ型膠原酶），于37 ℃搖床上震蕩消化30 min，在顯微鏡下觀察到大部分組織塊被消化成單細胞懸液后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，以300×g常溫離心8 min，棄上清液。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基重懸細胞沉淀，并接種于T25培養瓶中，采用差速貼壁法去除部分纖維細胞后，置于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中繼續培養。24 h后換液，加入10 μmol/L阿糖胞苷抑制成纖維細胞生長。第5天更換為含有毛喉素（2 μmol/L）、表皮生長因子-D（10 ng/ml）和1%青、鏈霉素混合液的培養基。此后每3 d更換1次培養液，常規傳代，選用第3～4代細胞用于后續實驗。

免疫熒光染色鑒定SC 將SC以1×105個/孔的密度均勻接種于預置有細胞爬片的12孔板。待細胞長成單層時，棄掉培養基，PBS浸洗3次，每次5 min，加入4%多聚甲醛固定15 min；PBS洗滌3次每次5 min，加入0.1% Triton-X100透化10 min；PBS浸洗3次每次5 min，加入3%山羊血清封閉20 min。隨后滴加一抗S100β（1∶200），4 ℃孵育過夜；洗滌后，滴加熒光二抗（1∶200），室溫濕盒中避光孵育1 h；PBS洗滌后，滴加DAPI，室溫下染色3～5 min。最后取出爬片，抗熒光淬滅劑封片后，置于熒光顯微鏡下觀察。

SC對PRP-exos的攝取 將SC以1×105個/孔的密度接種于預置有爬片的12孔板，待細胞自然貼壁。PRP-exos用PBS重懸，加入10 μmol/L的DiO熒光染料，于37 ℃避光孵育15 min以標記外泌體。將DiO標記的PRP-exos加入12孔板內與SC共培養24 h，棄掉培養基，PBS浸洗3次，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌后加入DAPI，室溫下染色3～5 min。取出爬片，抗熒光淬滅劑封片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。對照組用PBS稀釋等量DiO熒光染料，加入孔板中與SC共培養24 h，其余步驟相同。

EdU實驗檢測細胞增殖 將SC以1×105個/孔的密度均勻接種于12孔板，待細胞貼壁后，實驗組加入2 μl PRP-exos懸液，對照組加入等體積PBS，每組設置3個重復孔。培養24 h后，加入終濃度為10 μmol/L的EdU工作液，繼續培養24 h。棄掉培養基，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton-X100透化20 min。按照說明書，配制Click-iT反應混合物反應30 min，最后用DAPI標記細胞核，于熒光顯微鏡下拍攝圖像。采用Image J軟件進行細胞計數，EdU標記細胞占DAPI標記細胞總數的比例為EdU陽性率。EdU陽性率越高，細胞DNA復制活性越強，細胞增殖水平越高。

CCK-8法檢測細胞增殖 取生長狀態良好的SC均勻接種于96孔板（4 000個細胞/孔），待細胞貼壁后，加入含有0、10、20、40、80、160 μg/ml PRP-exos的完全培養基，于37 ℃、5% CO2條件下培養。每孔分別于0、24、48、72 h加入10 μl CCK-8溶液孵育3 h，用TECAN酶標儀檢測每孔在450 nm的吸光度值，每組設置5個重復孔。

統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計數資料以百分率表示；計量資料采用Kolmogorov-Smirnov法行正態性檢驗，若符合正態分布以均數±標準差表示，不符合正態分布以M（Q1，Q3）表示。Western blot實驗結果兩組均數間比較采用t檢驗，EdU法增殖活性分析兩組陽性率的比較采用t檢驗，CCK-8法細胞增殖分析采用重復測量的方差分析，事后分析組間多重比較采用Turkey法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結" 果

PRP-exos鑒定 透射電鏡觀察顯示，PRP-exos顆粒為圓形囊泡，呈茶托樣，可見典型的外泌體凹陷半球形結構（圖1A）。納米顆粒跟蹤分析技術顯示，納米顆粒的粒徑集中分布于50～150 nm之間，平均粒徑（122.8±38.7）nm（圖1B），濃度為3.5×1012個/ml。Western blot實驗結果顯示，提取的PRP-exos高表達外泌體表面標志蛋白CD63（t=21.240，Plt;0.001）、CD81（t=3.135，P=0.025）、CD9（t=3.998，P=0.004）和血小板膜糖蛋白CD41（t=2.914，P=0.032）（圖1C、D）。

SC鑒定 分離培養的SC在光學顯微鏡下呈雙極或三極的梭形，胞體具有折光性（圖2A）。免疫熒光染色結果顯示SC細胞質呈現出特異性分子標志物S100β表達陽性的紅色熒光（圖2B～D）。

SC對PRP-exos的攝取 激光共聚焦顯微鏡觀察顯示DAPI標記的SC細胞核呈藍色橢圓形熒光，DiO標記的PRP-exos呈綠色點狀熒光，PRP-exos組可見大量被DiO標記的PRP-exos出現在SC細胞質內，而對照組未見綠色點狀熒光（圖3）。

PRP-exos對SC增殖的影響 EdU實驗檢測結果顯示，與對照組比較，PRP-exos組SC的EdU陽性細胞百分率明顯增加（48.69%比28.07%；t=9.085，P＜0.001）（圖4A、B）。CCK-8法檢測結果顯示共培養24 h后，40、80、160 μg/ml PRP-exos組的SC增殖能力較0 μg/ml組增強（P=0.002，P=0.003，P=0.014）；共培養48 h后，20、40、80、160 μg/ml PRP-exos組的SC增殖能力較0 μg/ml組增強（P=0.038，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），40、80、160 μg/ml PRP-exos組的SC增殖能力較10 μg/ml組增強（P＜0.001，P＜0.001，P=0.005），40、80 μg/ml PRP-exos組的SC增殖能力較20 μg/ml組增強（P=0.006，P=0.022），而20 μg/ml與160 μg/ml PRP-exos組比較差異無統計學意義（P=0.052）；共培養72 h后，20、40、80、160 μg/ml PRP-exos組的SC增殖能力較0 μg/ml組增強（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），且與20、80、160 μg/ml組相比，40 μg/ml PRP-exos組的促SC增殖作用最強（P＜0.001，P=0.015，P＜0.001）。

討" 論

周圍神經損傷發病率高且預后不良，有效促進周圍神經的再生修復目前仍是再生醫學與神經科學的熱點與難點。SC作為周圍神經系統中最重要的結構和功能細胞，參與周圍神經再生修復的全過程。然而，在多數情況下，損傷部位SC的數量和增殖能力不足以支持受損神經完成再生。因此，尋找安全有效的方式來促進SC的增殖非常重要。本研究中，從健康志愿者的PRP中成功提取出外泌體（PRP-exos），經鑒定發現PRP-exos含量較多、純度較高，將其與SC體外共培養，發現PRP-exos可被SC攝取，且能夠顯著促進SC的增殖。這些研究結果為PRP-exos應用于周圍神經損傷的治療提供了實驗基礎。

在再生修復領域，PRP目前已廣泛應用于難治性創面和韌帶、肌腱、骨及軟骨損傷等疾病的治療［15-16］。在組織修復的過程中，PRP可促進相關細胞的增殖，如肌腱細胞、軟骨細胞等［17］。本課題組前期研究發現，PRP能夠促進SC的增殖，且加速了兔坐骨神經擠壓傷的神經修復［18］，提示PRP可增強神經的修復再生。但在臨床應用上，PRP仍面臨許多限制：一方面，PRP只能應用于自體治療，無法異體使用和大量生產，這極大地限制了其臨床應用范圍；另一方面，當前PRP制備方法不統一，存儲條件不一致，且質量受到供體年齡及健康狀態等因素的影響，這也導致了PRP臨床研究結局的不同［19］。PRP-exos作為PRP的二級衍生物，具有比PRP更豐富的生長因子含量，而且其免疫原性低，不僅不易引起不同個體間的免疫排斥反應，甚至可實現跨物種應用［20-21］。本研究結果顯示，提取的人PRP-exos含量豐富，純度很高，且可被體外培養的大鼠SC攝取，并顯著促進其增殖，進一步證實了PRP-exos的優勢。可見，PRP-exos有望解決PRP質量不一和來源受限的問題，從而拓寬甚至替代PRP成為再生修復治療的新手段。

當前，越來越多的學者開始關注PRP-exos促組織修復再生的作用。Guo等［14］及Xu等［22］發現，PRP-exos可促進成纖維細胞、人臍靜脈內皮細胞及角質形成細胞的增殖，并能加速慢性糖尿病潰瘍創面及皮膚全層缺損創面的愈合；Zhang等［23］發現PRP-exos可促進軟骨細胞的增殖，從而有利于軟骨損傷的修復；此外，還有學者分別發現PRP-exos可促進成骨細胞、骨髓間充質干細胞、微血管內皮細胞、髓核細胞、視網膜內皮細胞及神經干細胞的增殖，并促進相應組織的損傷修復［13，20，22，24-25］。本研究探究了PRP-exos對SC的影響，發現PRP-exos具有促進SC增殖的作用，既往研究僅對1～2個PRP-exos濃度對細胞的影響進行分析［13，14，22-24，26］，本研究設置了更詳細的濃度梯度，觀察不同濃度PRP-exos對SC增強的影響，結果顯示PRP-exos對SC的促增殖作用與其濃度具有一定的量效關系：一定范圍內，隨著濃度的增加，PRP-exos促增殖作用逐漸增強，當PRP-exos達40 μg/ml時，SC增殖最明顯，該結論與Tao等［13］及Guo等［14］的研究發現相近；當PRP-exos濃度增加至80和160 μg/ml時，SC的增殖幅度并未相應增加，表明過高濃度的PRP-exos并不能進一步促進SC的增殖。其原因可能為在本研究的培養條件下，當PRP-exos濃度為40 μg/ml時SC的增殖率已達到飽和；或者高濃度PRP-exos雜質亦較多，如脂蛋白等，這些雜質影響了培養環境；抑或是隨著共培養時間的延長，PRP-exos中核酸、細胞因子和小RNA等內容物逐漸引起SC其他表型發生改變，影響了增殖幅度，其具體機制還有待進一步研究。

此外，本研究采用聚合沉淀結合超速離心的方法提取PRP-exos，與當前常用的超速離心法相比，耗時更短，步驟更簡單，且獲得率更高；而與單純的試劑盒聚合沉淀法相比，提取PRP-exos的純度更高，兼具了兩者的優勢。

本研究尚存在一定的局限性。首先，PRP-exos被SC攝取后，PRP-exos內部的多種生長因子、蛋白質、信使RNA、微小RNA等活性物質轉移到SC，難以確定是何種或何類物質影響了SC的增殖。其次，本研究僅探索了PRP-exos對SC的增殖作用，未對其他表型與功能做進一步分析。

綜上，本研究結果表明，PRP中可提取較高濃度的PRP-exos，體外培養條件下，PRP-exos可促進大鼠SC的增殖，且當PRP-exos濃度為40 μg/ml時，其促SC增殖效果最佳。隨著生物工程和組織工程的發展，PRP-exos復合SC有望成為一種新的組織工程種子細胞，用于促進周圍神經損傷后的修復與再生。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2022-10-10）