多發(fā)性骨髓瘤小鼠模型構(gòu)建的研究進(jìn)展

摘要：多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞腫瘤，隨著其小鼠模型的不斷優(yōu)化創(chuàng)新，相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)展迅猛。基于人源細(xì)胞與免疫缺陷鼠的人源化小鼠模型在評估藥物療效、探索耐藥機(jī)制與觀察腫瘤-骨髓微環(huán)境相互作用等方面得到持續(xù)發(fā)展。近年來，基于鼠源細(xì)胞或基因編輯技術(shù)的同源小鼠模型在MM發(fā)病機(jī)制研究與藥物開發(fā)方面也開始被廣泛應(yīng)用；此外，建立穩(wěn)定的靶向臟器損傷模型正在成為MM小鼠模型未來發(fā)展的重要攻堅方向之一。本文綜述了各類MM小鼠模型的特點(diǎn)及其應(yīng)用的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：骨髓瘤；小鼠；模型

中圖分類號： R551.3" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A" 文章編號：1000-503X（2023）03-0512-07

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15288

Advances in Modeling of Multiple Myeloma in Mice

GU Xinyuan1，2，TANG Wenjiao1，LI Yan1，ZHANG Li1，ZHENG Yuhuan1

1Institute of Hematology，Department of Hematology，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China

2West China School of Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，China

Corresponding author：ZHANG Li Tel：028-85423046，E-mail：drzhangli2014@sina.com

ABSTRACT：Multiple myeloma（MM）is a systemic malignancy of plasma cells.Nowadays，the basic research on MM is flourishing with the continuous optimization and innovation of mouse models of MM.Heterologous mouse models of MM established with human-derived cells and immunodeficient mice have been applied in assessing drug efficacy，exploring drug resistance mechanisms，and observing tumor-bone marrow microenvironment interactions.In the last decades，the homologous mouse models of MM established with murine-derived cells or gene-editing technologies have been widely used in the research on the pathogenesis and drug development.Additionally，the stable modeling of targeted organ injury will be a key problem to be tackled in this field.This review summarizes the characteristics and application progress of mouse models of MM.

Key words：multiple myeloma；mouse；model

Acta Acad Med Sin，2023，45（3）：512-518

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細(xì)胞惡性增殖性疾病［1］，發(fā)病率在血液系統(tǒng)腫瘤中位列第二［2-3］。無論是從MM的發(fā)病機(jī)制到治療靶點(diǎn)，還是從精準(zhǔn)診斷到預(yù)后評價，其相關(guān)基礎(chǔ)研究的開展都離不開MM小鼠模型的建立。過去，MM小鼠模型主要著眼于MM疾病特征的模擬及腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的揭示，并衍生出MM治療方式的探索與評估；新藥時代的到來在MM小鼠模型領(lǐng)域又涌現(xiàn)出一系列新進(jìn)展，尤其在MM靶向臟器損傷模型領(lǐng)域，學(xué)科交叉與技術(shù)迭代使MM小鼠模型在一致性、可靠性、適用性三方面得到顯著提高。然而，現(xiàn)有的模型依然存在諸多不足。本文旨在針對不同MM小鼠模型的具體特征（表1）及該領(lǐng)域多年來的發(fā)展趨勢進(jìn)行綜述，為MM實(shí)驗?zāi)Ｐ偷倪x擇與建立提供參考。

人源化MM小鼠模型通過模擬人類MM疾病進(jìn)程為研究創(chuàng)造條件

20世紀(jì)中葉，免疫缺陷鼠開創(chuàng)了人源MM細(xì)胞移植模型新紀(jì)元，廣泛用于MM有效治療方式的尋找與評價。研究者使用BALB/c裸鼠構(gòu)建了首個MM免疫缺陷模型，基于該模型，MM信號通路研究及MM藥物療效的早期評估領(lǐng)域得以發(fā)展。近年來，有研究者應(yīng)用BALB/c裸鼠模型發(fā)現(xiàn)去泛素化酶Otub1能防止致癌轉(zhuǎn)錄因子c-Maf降解并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，因此靶向Otub1/c-Maf軸可作為MM的潛在治療方式［4］；也有研究在該模型中發(fā)現(xiàn)通過激活piRNA-823的表達(dá)，髓源性抑制細(xì)胞可促進(jìn)MM細(xì)胞的DNA甲基化，從而增加其致癌潛能［5］。需要注意的是，使用BALB/c裸鼠建立的MM動物模型仍具有B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK細(xì)胞），且NK細(xì)胞的活躍程度強(qiáng)于野生型小鼠；隨年齡增長該模型易出現(xiàn)T細(xì)胞滲漏，使皮下移植MM細(xì)胞的成瘤率受限。

20世紀(jì)90年代，人源化MM小鼠模型不斷深化免疫缺陷程度。重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠模型仍是目前最常用的MM小鼠模型之一，因16號染色體上Prkdc基因的隱性突變而無法正常進(jìn)行T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原受體基因的V（D）J重組，存在T、B細(xì)胞功能缺失，較BALB/c裸鼠模型表現(xiàn)出更廣泛的免疫抑制，有效提高人源MM細(xì)胞的移植成瘤率。近期，有研究者通過使用皮下注射OPM2細(xì)胞系的SCID小鼠MM模型，發(fā)現(xiàn)Smad1基因可調(diào)控NF-κB1/TNFAIP8和ID1-p21/p27這兩條MM耐藥關(guān)鍵軸，為靶向抑制治療MM耐藥提供潛在策略［6］；有研究采用SCID小鼠模型驗證了225Ac-Dotatate相較于177Lu-Dotatate在播散性MM免疫放射治療中具有更佳的療效［7］；在SCID小鼠模型體內(nèi)評價的89Zr-TiO2-Tf 納米顆粒放射性核素治療方案也被證實(shí)其在抑制MM細(xì)胞生長方面的效果［8］。但是，SCID小鼠MM建模的穩(wěn)定性仍受到其體內(nèi)留存的NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及髓系免疫細(xì)胞功能的影響。為進(jìn)一步加深小鼠模型的免疫缺陷程度，研究者建立了非肥胖型重性糖尿病合并免疫缺陷（non-obese diabetes-scid，NOD/SCID）小鼠模型。該模型在T、B細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷的基礎(chǔ)上，又具有極低的NK細(xì)胞活性。利用NOD/SCID小鼠MM模型，近期有研究發(fā)現(xiàn)通過激活CEP170途徑，細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶CHEK1和circCHEK1_246aa可以提高細(xì)胞內(nèi)染色體的不穩(wěn)定性，從而誘導(dǎo)MM細(xì)胞增殖、耐藥性產(chǎn)生及骨損傷形成［9］；也有研究同時使用皮下與脛骨注射的NOD/SCID小鼠MM模型，并驗證了載有熒光標(biāo)記siAIMP1的外泌體在體內(nèi)抑制MM細(xì)胞增殖及破骨細(xì)胞分化的作用［10］。值得注意的是，在對ARP1、MM.1S和NCI-H929移植NOD/SCID小鼠模型的對比研究發(fā)現(xiàn)，盡管皮下注射可使3種細(xì)胞系都在2周內(nèi)形成穩(wěn)定的局部腫瘤模型，但采用尾靜脈注射時僅有ARP1細(xì)胞系可于6周內(nèi)成功歸巢至骨髓腔，具有應(yīng)用于研究骨髓微環(huán)境對MM細(xì)胞影響的良好前景［11］。此后，基于NOD/SCID模型建立的NOD-SCID IL2rg-/-（NSG）小鼠模型，因其具有SCID以及Il2rg基因的雙重突變，NK細(xì)胞的發(fā)育完全受阻，免疫缺陷程度進(jìn)一步加深，從而更適應(yīng)人源MM細(xì)胞的移植。近年來，利用NSG小鼠MM模型，研究發(fā)現(xiàn)阻斷辣椒素受體TRPV1可發(fā)揮促M(fèi)M細(xì)胞的線粒體自噬及干擾胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的作用，并降低硼替佐米誘導(dǎo)的胞質(zhì)及線粒體蛋白的泛素化［12］；也有研究通過構(gòu)建新型靶向CS1蛋白遠(yuǎn)端V2結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體T細(xì)胞Luc90-CAR-T，驗證了其對MM細(xì)胞的顯著殺傷作用［13］。但是，上述小鼠模型均無法模擬MM骨髓微環(huán)境。為了實(shí)現(xiàn)人源化免疫微環(huán)境的模擬，研究者在Rag2-/-Il2rg-/-免疫缺陷鼠的背景上插入編碼人類巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白細(xì)胞介素3、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、信號調(diào)節(jié)蛋白α和血小板生成素的基因而建立了MIS（KI）TRG模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步導(dǎo)入白細(xì)胞介素6編碼基因形成MIS（KI）TRG6模型，為開展MM腫瘤免疫學(xué)研究提供了優(yōu)化平臺，但暫未得到廣泛應(yīng)用。

21世紀(jì)，免疫缺陷鼠-移植骨MM模型成功在小鼠體內(nèi)模擬人類骨髓微環(huán)境，有力揭示了腫瘤-骨髓微環(huán)境的相互作用。SCID-hu模型首次用人類胚胎骨為原代MM細(xì)胞提供生長環(huán)境，最大化程度模擬人體內(nèi)MM的發(fā)病環(huán)境；在人類胚胎骨中MM細(xì)胞的血管生成活躍，可應(yīng)用于MM的病理生理學(xué)研究。然而，SCID-hu模型存在造模量及倫理的限制；據(jù)此，研究者利用兔骨替代人類胚胎骨建立了SCID-rab模型。盡管與小鼠相比，兔與人骨髓微環(huán)境的相似度更高，但仍存在不可忽視的組織學(xué)差異。此后，SCID-synth-hu模型和NSG-synth-hu模型進(jìn)一步嘗試通過組織工程骨以復(fù)制正常人骨微結(jié)構(gòu)。然而由于組織工程骨并非自然骨，模型無法模擬MM的溶骨病變。盡管如此，免疫缺陷鼠-組織工程骨MM模型仍具有模擬MM骨髓微環(huán)境不可替代的優(yōu)勢。有研究者在植入組織工程骨的同時，將人骨髓細(xì)胞一并移植入NSG小鼠體內(nèi)；利用此方法建立的ohTEBC模型成功在小鼠體內(nèi)創(chuàng)造出人源化的骨髓生態(tài)位，可作為研究MM腫瘤-骨髓微環(huán)境相互作用的臨床前平臺［14］。

同源小鼠MM模型促進(jìn)對MM發(fā)病機(jī)制的探索及藥物研發(fā)

20世紀(jì)70年代，同源小鼠MM移植模型開啟了MM非免疫缺陷小鼠模型時代，使得MM相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)一步深入。最早建立的C57BL/KaLwRij小鼠MM模型及相應(yīng)的5T2MM小鼠細(xì)胞系，腫瘤進(jìn)展緩慢而廣泛，能夠呈現(xiàn)MM發(fā)生、發(fā)展的全過程，適用于模擬人類MM早期階段及MM臟器損害的研究。此外，因具有以成骨細(xì)胞減少和破骨細(xì)胞增加為特征的明顯骨溶解與骨小梁丟失，近年來C57BL/KaLwRij小鼠模型多應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤骨病（multiple myeloma bone disease，MMBD）的研究，如評估拮抗Wnt信號通路抑制因子骨硬化蛋白用于減輕MMBD的效果，并發(fā)現(xiàn)該途徑可使模型體內(nèi)的成骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且與唑來膦酸聯(lián)合使用能有效提高骨量與骨密度［15］；另有研究發(fā)現(xiàn)在骨髓微環(huán)境中，鈣缺乏可下調(diào)Lrp5基因表達(dá)，阻礙正常的骨重建過程并增強(qiáng)骨質(zhì)溶解，進(jìn)一步使MMBD迅速惡化［16］。然而，鼠源5T2MM細(xì)胞系也為C57BL/KaLwRij小鼠模型的應(yīng)用帶來限制，因其生長極度依賴小鼠骨髓微環(huán)境的支持，在體外基本無法培養(yǎng)；此外，該模型僅可模擬小鼠特定單克隆類型的MM，無法反映人類MM的高度異質(zhì)性。在后續(xù)研究中，C57BL/KaLwRij小鼠模型被不斷優(yōu)化，相繼建立了可在體外培養(yǎng)的5T33MM小鼠細(xì)胞系和生長更為迅速的5TGM1小鼠細(xì)胞系。近期，在使用5T33MM細(xì)胞系的C57BL/KaLwRij小鼠模型中，研究發(fā)現(xiàn)干擾MM細(xì)胞中的腺苷途徑可抑制腺苷的產(chǎn)生、激活T細(xì)胞、增加γ干擾素的產(chǎn)生而降低腫瘤負(fù)荷［17］；也有研究發(fā)現(xiàn)采用225Ac標(biāo)記抗CS1特異性單域抗體的放射性靶向治療，可在小鼠體內(nèi)增加CD8+T細(xì)胞數(shù)量以及程序性死亡配體1的表達(dá)，延長生存［18］。利用5TGM1小鼠MM模型，近期有研究發(fā)現(xiàn)唾液酸前體N-乙酰甘露糖胺可通過提高免疫球蛋白的唾液酰化程度，降低小鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞的吸收活性，從而減少溶骨病變的產(chǎn)生［19］。另有研究揭示了在意義未明的單克隆丙種球蛋白血癥，以及冒煙型MM階段，存在NK細(xì)胞增加、細(xì)胞毒性T細(xì)胞減少和CD14+單核細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子表達(dá)障礙，可反映MM發(fā)生過程中免疫微環(huán)境的早期變化過程［20］。在鼠源細(xì)胞系不斷優(yōu)化的同時，C57BL/KaLwRij小鼠也衍生出不同的亞系，如C57BL/6小鼠和C57BL/10小鼠，以及在C57BL/6小鼠基礎(chǔ)上培育出的C57BL/6J小鼠和C57BL/6N小鼠。由于易于繁殖且性情溫順，C57BL/6小鼠是除C57BL/KaLwRij小鼠外應(yīng)用最廣泛的MM同源模型動物之一［21-23］。雖然不同C57小鼠亞系間存在特定基因序列與生理特性的差異，但深入探討這些差異與MM相關(guān)性的研究仍較有限。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)相較于C57BL/6小鼠，C57BL/KaLwRij小鼠具有更高的Pttg1基因和更低的Samsn1基因表達(dá)，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的MM易感性與更快的疾病進(jìn)展速度［24-25］，然而目前暫無涉及C57BL/10小鼠、C57BL/6J小鼠與C57BL/6N小鼠應(yīng)用于MM造模的差異分析，因此仍需更多研究以全面比較不同C57亞系用于MM造模的優(yōu)劣勢。

20世紀(jì)末，轉(zhuǎn)基因小鼠模型有力推動了MM克隆動力學(xué)研究及臨床前藥物開發(fā)。由于小鼠自發(fā)產(chǎn)生的漿細(xì)胞腫瘤較為罕見，為獲得更多穩(wěn)定的MM動物模型，研究者建立了MM轉(zhuǎn)基因小鼠模型以更好地復(fù)制人類MM發(fā)病過程。通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子XBP-1s過表達(dá)所建立的Eμ-xbp-1s小鼠MM模型較適于模擬人類單克隆丙種球蛋白血癥或MMBD。該模型在11～20月齡時可觀察到血清單克隆免疫球蛋白（monoclonal lmmunoglobin，MIg）濃度及骨髓克隆漿細(xì)胞的增加，但此時未出現(xiàn)靶向臟器損傷，在14～24月齡時則可出現(xiàn)明顯的溶骨病變［26］。然而，涉及單個位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因模型的MM發(fā)生率依然無法滿足研究需要，為獲得發(fā)展速度更快或侵襲性更高的MM，研究者嘗試聯(lián)合多個修飾位點(diǎn)建立轉(zhuǎn)基因小鼠MM模型，其中最成功的為誘導(dǎo)Myc和Bcl-xl基因條件性過表達(dá)而建立的Vκ*MYC小鼠模型，常用于研究MM的發(fā)病機(jī)制、克隆動力學(xué)和臨床前藥物的開發(fā)。應(yīng)用Vκ*MYC小鼠模型，近期有研究采用第二代DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了MM驅(qū)動基因Wdr26和Mtf2，并可作為MM防治的潛在分子靶點(diǎn)［27］。另有研究通過血清蛋白電泳對Vκ*MYC小鼠體內(nèi)MIg水平進(jìn)行監(jiān)測，并評估MM疾病狀態(tài)，后采用疾病譜單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)在單克隆丙種球蛋白血癥、冒煙型MM及MM早期的不同時點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)差異化的亞克隆表達(dá)特點(diǎn)，且活動期的MM細(xì)胞異質(zhì)性是由轉(zhuǎn)錄變異性所驅(qū)動產(chǎn)生［28］。此外，以Vκ*MYC小鼠MM模型近年來也多用于MM發(fā)病機(jī)制及危險因素的研究，如有研究者發(fā)現(xiàn)草甘膦或四氯二苯并二英（TCDD）暴露下的Vκ*MYC小鼠會出現(xiàn)進(jìn)行性發(fā)展的血液學(xué)異常和漿細(xì)胞腫瘤，如脾腫大、貧血和高血清IgG，并導(dǎo)致溶骨病變和腎損傷等器官功能障礙。繼Vκ*MYC后，有十余種MM相關(guān)轉(zhuǎn)基因小鼠模型得到建立，近期有研究者在Vκ*MYC的背景上激活生發(fā)中心B細(xì)胞的內(nèi)源性Nras基因表達(dá)，成功構(gòu)建類似人類高危或復(fù)發(fā)MM的高度惡性MM小鼠模型［29］。

靶向臟器損傷模型正在成為MM小鼠模型平臺發(fā)展的重點(diǎn)攻堅方向之一

隨著MM相關(guān)基礎(chǔ)研究與造模技術(shù)的發(fā)展，MM小鼠模型在21世紀(jì)得到了長足發(fā)展。尤其值得關(guān)注的是，無論在人源化還是同源小鼠模型領(lǐng)域，靶向臟器損傷都成為目前MM小鼠模型的重點(diǎn)攻堅方向之一。

作為MM的最重要的靶向臟器損傷之一，超過79%的患者均會經(jīng)歷MMBD［30］。盡管如前文所述，已有部分基于小鼠模型的MMBD研究，但該領(lǐng)域仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前，多數(shù)MMBD模型采用易操作的股骨、脛骨進(jìn)行造模，無法復(fù)制臨床多見并嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量的脊柱損害。使用靜脈注射可在一定程度上獲得更廣泛的腫瘤累及部位，有研究經(jīng)尾靜脈將5TGM1-Luc細(xì)胞系注入NSG小鼠體內(nèi)，在股骨和腰椎均觀察到明顯的溶骨病變；然而，由于影響腫瘤細(xì)胞歸巢部位及數(shù)量的因素眾多［31］，使用靜脈注射造模難以獲得均勻的MM負(fù)荷分布，如通過尾靜脈注射建立的C57BL/KaLwRij小鼠模型雖然能夠產(chǎn)生與人類MMBD相近的疾病特征，但模型個體間存在骨損傷水平的顯著差異。此外，也有嘗試將原代MM細(xì)胞注射入SCID-hu小鼠模型中以觀察植入骨上所發(fā)生的溶骨病變；但受到倫理和成本等因素影響，SCID-hu小鼠模型暫未在MMBD研究領(lǐng)域被廣泛使用。

此外，值得關(guān)注的是，漿細(xì)胞源性的單克隆免疫球蛋白相關(guān)腎病（monoclonal immunoglobulin-associated renal diseases，MIgARD），可根據(jù)不同疾病負(fù)荷，分為以腎臟病變?yōu)橹鞯膯慰寺”N球蛋白病和MM相關(guān)腎損傷［32］，是漿細(xì)胞疾病領(lǐng)域內(nèi)醫(yī)學(xué)與科學(xué)的重要聚焦點(diǎn)之一。因此，MIgARD小鼠模型得到諸多關(guān)注。直接在小鼠腹腔內(nèi)大量注射高度提純后的人源游離輕鏈，即可呈現(xiàn)較明顯的腎毒性［33］；但由于輕鏈在外周循環(huán)的損耗，該MIgARD造模方法的損耗率較高，對模型體內(nèi)其他器官也存在損傷風(fēng)險。另有研究嘗試在小鼠陰莖背靜脈注射人源游離輕鏈，可有效避免其進(jìn)入門靜脈循環(huán)發(fā)生的稀釋，并減少首過效應(yīng)的損耗。此外，研究顯示在不同MM轉(zhuǎn)基因小鼠模型體內(nèi)也存在MIg的腎沉積，如Eμ-xbp-1s小鼠腎小球中可出現(xiàn)IgG和Ig κ的沉積，而約有50%的Vκ*MYC小鼠可檢測到以MIg沉積為主的腎小球病理改變［34］。需要強(qiáng)調(diào)的是，人源免疫球蛋白片段能否在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定存在仍是一個存在爭議的話題，免疫球蛋白片段的不同類型及負(fù)荷量也將影響MMBD造模的疾病表現(xiàn)，MIgARD小鼠模型仍在積極完善中。

總結(jié)和展望

現(xiàn)有MM小鼠模型均無法全程模擬MM在人體中發(fā)生發(fā)展的演變過程。MM的發(fā)生發(fā)展過程受到遺傳因素和骨髓微環(huán)境的雙重影響，如何能夠更好地模擬腫瘤骨髓微環(huán)境中的交互作用，成為MM小鼠模型建立首需克服的困難。此外，人MM病程漫長且復(fù)雜，疾病早期即可有超二倍體或基因位點(diǎn)易位等始動事件，疾病發(fā)展中還受到染色體易位、缺失、多倍體等突變特征的影響，如何利用有限生命周期的小鼠模型反映MM疾病進(jìn)程中的遺傳變化成為難點(diǎn)。最后，作為一種可累及全身各系統(tǒng)的惡性腫瘤，MM在不同患者個體中的靶向臟器損傷呈現(xiàn)明顯異質(zhì)性，模擬MM在人體引發(fā)多器官損傷的小鼠模型尚處起步階段，暫未形成同行公認(rèn)。因此，研究者應(yīng)在熟知不同MM小鼠模型優(yōu)勢與局限的基礎(chǔ)上，根據(jù)研究目的與需求選擇最合適的模型或考慮多種模型的聯(lián)合使用。需要指出的是，除小鼠作為目前最常用的MM模型動物外，還有利用大鼠和兔進(jìn)行造模［35-36］的嘗試，且在犬和貓中已有多篇自發(fā)MM的報道［37-40］，均為未來MM動物模型的持續(xù)發(fā)展提供了基礎(chǔ)和啟示。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-09-13）