清道夫受體B1基因啟動子甲基化與冠心病的關(guān)聯(lián)分析

摘要：目的 探討清道夫受體B1（SCARB1）基因啟動子區(qū)域甲基化與冠心病發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。方法 選取2018年12月至2020年5月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院就診的120例冠心病患者作為病例組，并隨機選取同期健康體檢人群中性別和年齡匹配的140名健康受試者作為對照組，進行病例對照研究。采用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，擴增目標(biāo)區(qū)域后采用高通量測序?qū)蚪M進行甲基化檢測，分析兩組SCARB1基因啟動子區(qū)域CpG位點的甲基化差異。結(jié)果 病例組SCARB1+67基因的甲基化水平顯著高于對照組（Plt;0.001），SCARB1+134基因的甲基化水平顯著低于對照組（Plt;0.001），且在男性（P均lt;0.001）、女性（P均lt;0.001）冠心病患者中與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。病例組SCARB1基因的平均甲基化水平顯著低于對照組［（80.27±2.14）%比（81.11±1.27）%；P=0.006］，且只在男性冠心病患者中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）。結(jié)論 SCARB1基因的甲基化水平與冠心病的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，可能參與其發(fā)生發(fā)展過程。

關(guān)鍵詞：冠心病；清道夫受體B1；啟動子；DNA甲基化

中圖分類號： R34" 文獻標(biāo)志碼： A" 文章編號：1000-503X（2023）03-0405-05

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15488

Association Analysis Between Methylation of SCARB1 Gene Promoter and Coronary Heart Disease

LI Wei，WANG Zhenhua，SHI Peng，XUE Song

Department of Cardiovascular Surgery，Renji Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200127，China

Corresponding author：XUE Song Tel：021-68383704，E-mail：xuesong64@163.com

ABSTRACT：Objective To explore the relationship between scavenger receptor class B member 1 （SCARB1） gene promoter methylation and the pathogenesis of coronary artery disease.Methods A total of 120 patients with coronary heart disease treated in Renji Hospital affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine from December 2018 to May 2020 were selected as the case group，while 140 gender and age matched healthy participants were randomly selected as the control group for a case-control study.The methylation status was detected by high-throughput target sequencing after bisulfite converting，and the methylation of CpG sites in the promoter region of SCARB1 gene was compared between the two groups.Results The case group showed higher methylation level of SCARB1+67 and lower methylation level of SCARB1+134 than the control group （both Plt;0.001），and the differences remained statistically significant in men （both Plt;0.001） and women （both Plt;0.001）.The overall methylation level in the case group was lower than that in the control group ［（80.27±2.14）% vs.（81.11±1.27）%；P=0.006］，while this trend was statistically significant only in men （P=0.002）.Conclusion The methylation of SCARB1 gene promotor is associated with the pathogenesis and may participate in the occurrence and development of coronary heart disease.

Key words：coronary heart disease；scavenger receptor class B member 1；promoter；DNA methylation

Acta Acad Med Sin，2023，45（3）：405-409

冠心病是因受環(huán)境、遺傳等多種因素的影響冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，血脂代謝異常在動脈粥樣硬化形成過程中起著決定性作用。清道夫受體B1（scavenger receptor class B member 1，SCARB1）基因編碼的高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）受體能夠以一種不同于經(jīng)典的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受體途徑的方式介導(dǎo)選擇性吸收HDL中的膽固醇，減輕血管動脈硬化的進程。既往研究發(fā)現(xiàn)SCARB1基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點與冠心病的發(fā)病關(guān)聯(lián)［1］，SCARB1基因功能缺陷者體內(nèi)HDL濃度顯著高于正常人群，患冠心病的風(fēng)險也更高。甲基化是DNA化學(xué)修飾的一種形式，在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，基因組CpG位點二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團，在不改變DNA序列的情況下引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性與表達。基因啟動子區(qū)域的過甲基化與低甲基化水平可以顯著影響心腦血管、腫瘤、代謝性疾病的發(fā)病風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵基因的甲基化水平變化與冠心病的進展關(guān)聯(lián)［2-3］。SCARB1基因是脂代謝過程中的重要基因，其甲基化水平是否與冠心病發(fā)生存在關(guān)聯(lián)尚不清楚。本研究采用目標(biāo)區(qū)域甲基化測序技術(shù)，檢測冠心病患者與健康人群SCARB1基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，探討其在冠心病發(fā)病中的作用，進一步揭示冠心病的發(fā)生機制。

對象和方法

對象 選取2018年12月至2020年5月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院就診的120例冠心病患者作為病例組，并隨機選取同期健康體檢人群中性別和年齡匹配的140名健康受試者作為對照組，進行病例對照研究。病例組入組標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動脈造影示冠狀動脈或其主要分支狹窄大于或等于50%；所有入試者為無親緣關(guān)系的中國漢族人群。本研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)（倫理審批編號：KY2021-159-B），所有研究對象均簽署知情同意書。

血液DNA提取 采集5 ml靜脈血至EDTA抗凝管，保存于-80 ℃冰箱。根據(jù)TIANamp Genomic DNA Kit［天根生化科技（北京）有限公司］操作說明書進行血液基因組DNA的提取，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測DNA的質(zhì)量和濃度，并置于-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

DNA甲基化水平檢測 每個血液樣本取200 ng，按照EZ DNA Methylation-Gold Kit（Zymo Research公司，美國）試劑盒說明書進行DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。采用MethPrimer軟件（http：//www.urogene.org/methprimer）對轉(zhuǎn)換后的序列進行特異性擴增引物設(shè)計，PCR引物由上海芙蕊生物科技有限公司進行合成。SCARB1引物序列：引物1上游引物：5′-TTGAGTAGTTGGGGTTAG-AAGTATTT-3′，下游引物：5′-ACAACACCAAACCACCTA-AAAATATA-3′；引物2上游引物：5′-TTTGGAGAAT-ATTTGGAGGAGAATA-3′，下游引物：5′-TAACCAATAATTAAAACTCCCTAAAAAC-3′。利用轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行多重PCR，擴增目的CpG位點。PCR反應(yīng)總體系為50.0 μl，包括4.0 μl亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA、2.5 μl正向引物、2.5 μl反向引物、25.0 μl 2倍多重PCR 酶反應(yīng)混合液［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］、16.0 μl無核酸酶水。PCR擴增反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，最后1個72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序，所有樣本平均測序深度大于500 X。測序結(jié)果采用FLASH軟件（http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml）對通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進行配對連接，結(jié)合BWA（https：//bio-bwa.sourceforge.net）和Samtools軟件（http：//www.htslib.org/doc/samtools.html），將序列比對到目標(biāo)參考序列上，獲得CpG位點信息，并通過計算甲基化的胞嘧啶和總胞嘧啶的比例來評估CpG位點的甲基化程度，區(qū)域基因甲基化水平為所有CpG位點的平均甲基化水平。CpG位點根據(jù)其距離轉(zhuǎn)錄起始位點的位置進行命名。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析DNA甲基化與血脂水平之間的相關(guān)性。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)" 果

一般情況 120例冠心病患者中，男88例，女32例，平均年齡（64.6±9.58）歲，HDL-膽固醇（HDL cholesterol，HDL-C）（1.0±0.23）mmol/L，LDL-膽固醇（LDL cholesterol，LDL-C）（2.2±0.86）mmol/L，總膽固醇（total cholesterol，TC）（3.9±0.95）mmol/L，甘油三酯（triglyceride，TG）（1.6±0.79）mmol/L，載脂蛋白A（apolipoprotein A，ApoA）（281.9±338.63）mg/L，ApoA1（1.0±0.19）g/L，ApoB（0.8±0.27）g/L，空腹血糖（6.5±2.62）mmol/L，高血壓56例（48%），糖尿病51例（44%），ApoE（3.57±1.25）mg/dl；140例健康受試者中，男93例，女47例，平均年齡（62.8±10.18）歲。病例組和對照組在性別和年齡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.228，P=0.132）。

SCARB1基因甲基化與冠心病的關(guān)聯(lián)性 病例組和對照組SCARB1基因啟動子區(qū)域共有4個CpG位點，分別為SCARB1-174、SCARB1-105、SCARB1+67和SCARB1+134（圖1），其中病例組SCARB1+67甲基化水平顯著高于對照組［（83.33±2.80）%比（77.95±2.43）%；Plt;0.001］，SCARB1+134甲基化水平顯著低于對照組［（56.08±3.97）%比（63.33±3.01）%；Plt;0.001］，而SCARB1-174和SCARB1-105甲基化水平兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.350，P=0.605）。基因甲基化分析結(jié)果顯示，病例組SCARB1基因的平均甲基化水平顯著低于對照組［（80.27±2.14）%比（81.11±1.27）%；P=0.006］。

不同性別SCARB1基因甲基化與冠心病的關(guān)聯(lián)性 按照性別進行分層分析SCARB1基因啟動子甲基化與冠心病的關(guān)系，結(jié)果顯示在男性、女性冠心病患者中SCARB1+67（P均lt;0.001）、SCARB1+134基因（P均lt;0.001）的甲基化水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而SCARB1-174和SCARB1-105基因的甲基化水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均gt;0.05）（表1）。男性病例組SCARB1基因的平均甲基化水平顯著低于對照組［（80.15±1.85）%比（81.17±1.09）%；P=0.002］，而在女性病例組和對照組SCARB1基因的平均甲基化水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義［（80.58±2.79）%比（80.99±1.56）%；P=0.456］。

冠心病患者SCARB1基因甲基化與血脂水平的關(guān)聯(lián)性 Pearson相關(guān)分析顯示，冠心病患者SCARB1+67基因與HDL-C水平顯著相關(guān)（r=0.195，P=0.040）（圖2），而SCARB1-174（r=-0.028，P=0.813）、SCARB1-105（r=0.041，P=0.709）、SCARB1+134基因（r=0.005，P=0.956）的CpG位點與HDL-C水平無相關(guān)性，且SCARB1基因與TG、TC、LDL-C均無相關(guān)性（P均gt;0.05）。

討" 論

SCARB1基因位于染色體12q24區(qū)域，包含13個外顯子，編碼509個氨基酸的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為82 000，研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)域與HDL-C水平存在一定的關(guān)聯(lián)。SCARB1基因是第1個被發(fā)現(xiàn)的HDL配體，在膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中起著重要的作用，對血脂水平以及動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要的影響［4］。

DNA甲基化作為最常見的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，與基因的表達密切關(guān)聯(lián)。基因啟動子區(qū)域的過甲基化可阻斷轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合，或者改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而抑制基因的表達［5］。DNA甲基化在脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)中起著重要作用［6］，與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，基因啟動子區(qū)域的甲基化改變可能與冠心病的發(fā)生相關(guān)，并在不同人群中有所差異［8-9］。DNA甲基化可以調(diào)控基因表達從而影響脂代謝，但造成甲基化差異的原因并不清楚。既往研究表明甲基化可能與遺傳有關(guān)，也可能受附近SNP的影響［10］。研究發(fā)現(xiàn)遺傳和表觀遺傳的交互作用會導(dǎo)致復(fù)雜疾病的發(fā)生［11］。

本研究對SCARB1基因進行目標(biāo)區(qū)域甲基化測序，分析中國漢族人群冠心病患者SCARB1基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。基于高通量測序的甲基化檢測與傳統(tǒng)的甲基化特異性PCR或定量PCR相比，可以更準(zhǔn)確地獲得每個CpG位點的甲基化水平。有文獻報道SCARB1基因的SNP多態(tài)性與動脈疾病或血脂水平關(guān)聯(lián)，特別是與血清HDL-C水平關(guān)聯(lián)，但在不同人種中的結(jié)果并不一致［12］。多項動物模型研究顯示肝臟過量表達SCARB1基因可導(dǎo)致HDL-C和ApoA1水平顯著降低，從而增加膽汁膽固醇的分泌；相反，干擾SCARB1目標(biāo)基因可減少膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程中選擇性膽固醇酯的吸收，造成HDL-C水平的升高［13］。SCARB1基因變異與其微小RNA表達量相關(guān)，但藥物治療并不調(diào)節(jié)SCARB1基因微小RNA的表達水平［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCARB1基因在冠心病和健康人群中的甲基化水平存在差異，并且冠心病患者SCARB1基因甲基化程度與HDL-C水平相關(guān)，提示脂代謝基因的甲基化程度可能影響血脂水平。因此，DNA甲基化可以作為預(yù)測冠心病發(fā)病風(fēng)險的潛在分子標(biāo)志物［15-16］。

性別是影響冠心病發(fā)病的重要因素之一，我國冠心病男性患者的患病率和死亡率顯著高于女性，且發(fā)病年齡也早于女性。本研究通過分層分析發(fā)現(xiàn)，性別與SCARB1基因甲基化對冠心病的發(fā)病存在交互作用。Hsiung等［17］研究也發(fā)現(xiàn)男性和女性在全基因組甲基化譜中存在差異。不同性別在性激素水平上存在差異，而雌激素和雄激素可以通過DNA甲基化的改變調(diào)節(jié)基因的表達，可能是導(dǎo)致冠心病發(fā)病率差異的原因［18］。

本研究也存在一些局限性：如樣本量較小，需要在更大的樣本中驗證本研究的結(jié)果；未根據(jù)疾病嚴重程度、病史、用藥情況、預(yù)后等因素進行分析；甲基化變化是否影響基因和蛋白的表達等，因此需要在后續(xù)研究中增加樣本量，并結(jié)合SCARB1基因表達量進行深入分析，明確甲基化變化對基因表達的影響，進一步闡明SCARB1基因在冠心病發(fā)生發(fā)展中的作用機制。

綜上，本研究結(jié)果表明，冠心病患者SCARB1基因的平均甲基化水平低于健康對照者，并且存在性別差異，其中SCARB1+67、SCARB1+134基因的甲基化水平差異顯著，提示SCARB1基因的甲基化與冠心病的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，可以作為診斷冠心病的潛在標(biāo)志物。通過檢測SCARB1基因的甲基化水平，對冠心病高危人群進行篩選，從而實現(xiàn)二級預(yù)防的目的；同時，為進一步研究冠心病的發(fā)生機制提供新的思路。

參 考 文 獻

［1］Manichaikul A，Naj AC，Herrington D，et al.Association of SCARB1 variants with subclinical atherosclerosis and incident cardiovascular disease：the multi-ethnic study of atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（8）：1991-1999.DOI：10.1161/ATVBAHA.112.249714.

［2］Li X，Wu N，Ji H，et al.A male-specific association between AGTR1 hypermethylation and coronary heart disease［J］.Bosn J Basic Med Sci，2020，20（1）：31-36.DOI：10.17305/bjbms.2019.4321.

［3］An F，Liu C，Wang X，et al.Effect of ABCA1 promoter methylation on premature coronary artery disease and its relationship with inflammation［J］.BMC Cardiovasc Disord，2021，21（1）：78.DOI：10.1186/s12872-021-01894-x.

［4］Liu Y，Ordovas JM，Gao G，et al.The SCARB1 gene is associated with lipid response to dietary and pharmacological interventions［J］.J Hum Genet，2008，53（8）：709-717.DOI：10.1007/s10038-008-0302-2.

［5］Weber M，Davies JJ，Wittig D，et al.Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells［J］.Nat Genet，2005，37（8）：853-862.DOI：10.1038/ng1598.

［6］He Z，Zhang R，Jiang F，et al.Role of genetic and environmental factors in DNA methylation of lipid metabolism［J］.Genes Dis，2018，5（1）：9-15.DOI：10.1016/j.gendis.2017.11.005.

［7］Zhang L，Lu Q，Chang C.Epigenetics in health and disease［J］.Adv Exp Med Biol，2020，1253：3-55.DOI：10.1007/978-981-15-3449-2_1.

［8］Cai G，Huang Z，Yu L，et al.A preliminary study showing no association between methylation levels of C3 gene promoter and the risk of CAD［J］.Lipids Health Dis，2019，18（1）：5.DOI：10.1186/s12944-018-0949-4.

［9］Navas-Acien A，Domingo-Relloso A，Subedi P，et al.Blood DNA Methylation and incident coronary heart disease：evidence from the strong heart study［J］.JAMA Cardiol，2021，6（11）：1237-1246.DOI：10.1001/jamacardio.2021.2704.

［10］Lu T，Klein KO，Colmegna I，et al.Whole-genome bisulfite sequencing in systemic sclerosis provides novel targets to understand disease pathogenesis［J］.BMC Med Genomics，2019，12（1）：144.DOI：10.1186/s12920-019-0602-8.

［11］Dayeh TA，Olsson AH，Volkov P，et al.Identification of CpG-SNPs associated with type 2 diabetes and differential DNA methylation in human pancreatic islets［J］.Diabetologia，2013，56（5）：1036-1046.DOI：10.1007/s00125-012-2815-7.

［12］Niemsiri V，Wang X，Pirim D，et al.Impact of genetic variants in human scavenger receptor class B type I （SCARB1） on plasma lipid traits［J］.Circ Cardiovasc Genet，2014，7（6）：838-847.DOI：10.1161/CIRCGENETICS.114.000559.

［13］Su Z，Leduc MS，Korstanje R，et al.Untangling HDL quantitative trait loci on mouse chromosome 5 and identifying Scarb1 and Acads as the underlying genes［J］.J Lipid Res，2010，51（9）：2706-2713.DOI：10.1194/jlr.M008110.

［14］Cerda A，Genvigir FD，Rodrigues AC，et al.Influence of polymorphisms and cholesterol-lowering treatment on SCARB1 mRNA expression［J］.J Atheroscler Thromb，2011，18（8）：640-651.DOI：10.5551/jat.6544.

［15］Agha G，Mendelson MM，Ward-Caviness CK，et al.Blood leukocyte DNA methylation predicts risk of future myocardial infarction and coronary heart disease［J］.Circulation，2019，140（8）：645-657.DOI：10.1161/CIRCULATIONAHA.118.039357.

［16］Zhao X，Zhu L，Yin Q，et al.F2RL3 Methylation in the peripheral blood as a potential marker for the detection of coronary heart disease：a case-control study［J］.Front Genet，2022，13：833923.DOI：10.3389/fgene.2022.833923.

［17］Hsiung DT，Marsit CJ，Houseman EA，et al.Global DNA methylation level in whole blood as a biomarker in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007，16（1）：108-114.DOI：10.1158/1055-9965.EPI-06-0636.

［18］Sebag IA，Gillis MA，Calderone A，et al.Sex hormone control of left ventricular structure/function：mechanistic insights using echocardiography，expression，and DNA methylation analyses in adult mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，301（4）：H1706-H1715.DOI：10.1152/ajpheart.00088.2011.

（收稿日期：2023-01-09）