奶牛布病免疫抗體與自然感染抗體鑒別診斷的探索

摘要：奶牛布病是重要的人畜共患病之一。國(guó)家從實(shí)施穩(wěn)控到提出凈化，對(duì)此給予了高度重視。在基層診斷和實(shí)施凈化過程中，檢測(cè)起著關(guān)鍵作用。臨床檢測(cè)中，常存在免疫后的奶牛出現(xiàn)臨床癥狀，存在布病免疫抗體還是感染抗體不易區(qū)分的現(xiàn)象，給基層診斷和凈化工作帶來了困難。本文主要介紹了奶牛布病免疫抗體與自然感染抗體鑒別診斷現(xiàn)狀，并結(jié)合臨床實(shí)踐篩選出虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)、瓊擴(kuò)試驗(yàn)、熒光偏振試驗(yàn)等四種不同組合鑒別方法，僅供參考。

關(guān)鍵詞：布病；試管凝集；診斷；檢測(cè)試劑；奶牛

1 布病檢測(cè)及鑒別診斷現(xiàn)狀

布病的常規(guī)血清學(xué)診斷方法以光滑型脂多糖（S-LPS）抗原為基礎(chǔ)，包括虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）等。除S-LPS分子外，光滑型布魯氏菌表面還有一種天然半抗原（native hapten，NH）。有研究表明[1]，接種疫苗的動(dòng)物血清中檢測(cè)不到NH抗體的存在，而野毒感染血清中能夠檢測(cè)到NH抗體的存在。目前，市場(chǎng)上有布魯氏菌抗體瓊擴(kuò)（AGID）檢測(cè)試劑盒，它是利用光滑型布魯氏菌表面的一種天然半抗原來鑒定布病疫苗免疫和野毒感染的方法。另外，熒光偏振試驗(yàn)（FPA）作為新興的布魯氏菌病檢測(cè)方法，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）在2016年批準(zhǔn)了 FPA法用于牛布病的驗(yàn)證診斷以及羊和豬布病的檢測(cè)。在我國(guó)，熒光偏振試驗(yàn)（FPA）也在現(xiàn)行的《國(guó)家布魯氏菌病防治計(jì)劃（2016—2020年）》中被列為動(dòng)物布病的初篩試驗(yàn)。與前述的傳統(tǒng)血清學(xué)診斷方法相比，熒光偏振試驗(yàn)（FPA）操作簡(jiǎn)便，能夠快速給出結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)室和儀器之間具有高度的可重復(fù)性。此外，傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)方法的抗原大多是布魯氏菌細(xì)胞膜上的光滑脂多糖（S-LPS），而FPA的抗原分子使用的是光滑脂多糖（S-LPS）中最具有免疫原性優(yōu)勢(shì)的O-多糖（OPS），這使得FPA法能夠區(qū)分免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物，疫苗免疫后動(dòng)物體內(nèi)OPS抗體水平非常低，而自然感染動(dòng)物體內(nèi)抗體水平高。有報(bào)道顯示[2]，F(xiàn)PA的敏感性和特異性均很高，能達(dá)到90.02%和99.96%。鑒于上述報(bào)道，筆者結(jié)合實(shí)際工作，對(duì)奶牛布病自然感染抗體和疫苗免疫抗體鑒別診斷進(jìn)行了探索，總結(jié)出以下四種方案。

2 鑒別診斷方案的確立試驗(yàn)

2.1 鑒別診斷篩選方案（一）

1）試驗(yàn)對(duì)象 采集未免疫布病或免疫期超過18個(gè)月的奶牛血清12，567份。

2）試驗(yàn)方法 ①虎紅平板凝集試驗(yàn)參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.4操作；②試管凝集試驗(yàn)參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.6操作；③競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.9操作。

3）試驗(yàn)結(jié)果 虎紅平板凝集試驗(yàn)初篩79份陽性，試管凝集試驗(yàn)或競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)復(fù)核出陽性20份，結(jié)果見表1。

4）結(jié)論與分析 由結(jié)果可見虎紅平板凝集試驗(yàn)的假陽性率還是很高的。未免疫機(jī)體或免疫超過18個(gè)月（疫苗抗體已經(jīng)降低到檢測(cè)程度以下），通過虎紅平板凝集試驗(yàn)初篩，試管凝集試驗(yàn)或競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)復(fù)核陽性者可視為野毒感染牛。

2.2 鑒別診斷篩選方案（二）

1）試驗(yàn)對(duì)象 采集免疫18個(gè)月內(nèi)的無癥狀牛群血清5，179份。

2）試驗(yàn)方法 ①虎紅平板凝集試驗(yàn)參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.4操作；②試管凝集試驗(yàn)參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.6操作；③競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.9操作；④布魯氏菌抗體瓊擴(kuò)（AGID）試驗(yàn)參照試劑盒（青島瑞爾唯特生物技術(shù)有限公司）說明書操作。操作步驟：將15μL陽性對(duì)照和15μL陰性對(duì)照加入瓊脂板側(cè)面的2個(gè)孔中。在瓊脂板側(cè)面剩下的孔中加入15μL待測(cè)血清。將15μL抗原加入到中央孔中。將接種好的瓊脂板在培養(yǎng)箱中室溫孵育24～48h；結(jié)果讀取及解釋：在24h和48h后讀取結(jié)果，使用斜射光源。沒有沉淀線意味著動(dòng)物沒有被感染。

3）試驗(yàn)結(jié)果 在試驗(yàn)?zāi)膛?chǎng)采集免疫18個(gè)月內(nèi)奶牛血樣5，179份，進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)篩選，陽性數(shù)3，211份，陽性率62%（見表2）。抽檢陽性血樣392份進(jìn)行布病抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)，陽性數(shù)321份，符合率81.88%（見表3）。選擇布病競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)陽性的血清150份（無癥狀牛）進(jìn)行布病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果顯示抗體均為陰性（見表4）。

4）結(jié)論與分析 免疫18個(gè)月內(nèi)無臨床癥狀牛群，虎紅平板凝集試驗(yàn)，競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)為陽性均不能區(qū)分是免疫抗體還是野毒抗體。通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)復(fù)核，虎紅平板凝集試驗(yàn)陽性樣本，瓊擴(kuò)均為陰性，且臨床健康，可視為抗體為疫苗抗體。

2.3 鑒別診斷篩選方案（三）

1）試驗(yàn)對(duì)象 采集免疫接種18個(gè)月內(nèi)，個(gè)別出現(xiàn)臨床癥狀的奶牛群血樣279份。

2）試驗(yàn)方法 ①虎紅平板凝集試驗(yàn)參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.4操作；②試管凝集試驗(yàn)參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.6操作；③競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.9操作；④布魯氏菌抗體瓊擴(kuò)（AGID）試驗(yàn)參照2.2之2）中方法操作。

3）試驗(yàn)結(jié)果 采用虎紅平板凝集試驗(yàn)篩選出181份陽性牛血，再采用試管凝集試驗(yàn)復(fù)核陽性150份（1：100血清稀釋管內(nèi)出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象），將檢測(cè)陽性的血樣進(jìn)行布病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，陽性17份，具體見表5。

4）結(jié)論與分析 免疫接種18個(gè)月內(nèi)個(gè)別出現(xiàn)臨床癥狀的奶牛群，虎紅平板凝集陽性和試管凝集陽性不能判定免疫抗體還是野毒抗體，瓊脂擴(kuò)散復(fù)核后陽性，且有臨床癥狀的個(gè)體視為野毒感染。即免疫期在18個(gè)月內(nèi)的非健康奶牛群，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，臨床癥狀，進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)以及布病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)區(qū)分自然感染抗體與免疫抗體鑒別診斷，瓊擴(kuò)復(fù)核陽性個(gè)體視為野毒感染牛。

2.4 鑒別診斷篩選方案（四）

1）試驗(yàn)對(duì)象 免疫情況不明，曾出現(xiàn)個(gè)別流產(chǎn)現(xiàn)象牛群，且虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)均為陽性的25份樣品。

2）試驗(yàn)方法 ①虎紅平板凝集試驗(yàn)參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.4操作；②試管凝集試驗(yàn)參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.6操作；③競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）參照GB/T 18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中4.9操作；④布魯氏菌抗體瓊擴(kuò)（AGID）試驗(yàn)參照2.2之2）操作；⑤熒光偏振試驗(yàn)參照試劑盒說明書操作。試驗(yàn)步驟：移取20μL陰陽對(duì)照和樣品到玻璃管/深孔條的所有管或孔中。將陰性對(duì)照一式三份、一份陽性對(duì)照和待檢樣品分別加入玻璃管/深孔條的所有管或孔中。移取1mL樣品稀釋劑到10×75mm玻璃管中。仔細(xì)混合；室溫下孵育2～5min。獲取所有樣品和對(duì)照的空白讀數(shù)。在含有對(duì)照和樣品的所有管中加入10μL示蹤劑，仔細(xì)混合。在室溫下孵育2～5min。獲得所有樣品和對(duì)照的mP讀數(shù)；結(jié)果判定：ΔmP≤10判為陰性，ΔmP介于10～20判為可疑，ΔmP＞20判為陽性（ΔmP=樣品mP值-陰性對(duì)照平均mP值）。陽性和可疑樣品必須重新檢測(cè)兩次，如果兩次重檢的結(jié)果都是ΔmP≤10，則判定為陰性，如果兩次重檢中有任何一次結(jié)果ΔmP＞10，則判定為陽性。疫苗免疫區(qū)或部分高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，由于環(huán)境和流行病學(xué)的存在，建議采用如下截?cái)嘀担害P≤40判為陰性。ΔmP介于40～60判為可疑，ΔmP＞60判為陽性。

3）試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)均為陽性的25份樣品進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，結(jié)果見表6。

對(duì)照臨床癥狀，對(duì)比幾種試驗(yàn)得出：①瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)除1份外均為陽性；②競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)與試管凝集符合率80%，出現(xiàn)臨床癥狀的樣品競(jìng)爭(zhēng)ELISA均為陽性；③瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)與臨床癥狀符合率96%；④熒光偏振試驗(yàn)與臨床癥狀陽性符合率100%。樣品mP的值在150～180之間，陽性率達(dá)到98%，熒光偏振總體符合率60%，熒光偏振試驗(yàn)受免疫影響出現(xiàn)非感染性陽性的現(xiàn)象。

4）結(jié)論與分析 有臨床癥狀，且瓊擴(kuò)陽性或者熒光偏振陽性的可視為野毒感染。雖然NH-GD試驗(yàn)也有敏感性低等不足，這與布魯氏菌產(chǎn)生的抗原刺激強(qiáng)弱有關(guān)，因此沒有出現(xiàn)NH沉淀帶不一定是布病陰性動(dòng)物；但其特異性非常高，沒有一種實(shí)驗(yàn)方法能夠達(dá)到100%的敏感性和特異性，因此可用敏感性高的RBT進(jìn)行初篩實(shí)驗(yàn)，再用特異性高的NH-GD試驗(yàn)進(jìn)行確診。此外，熒光偏振試驗(yàn)（FPA）在有經(jīng)濟(jì)能力的場(chǎng)可用于布魯氏菌病的鑒別診斷。牛場(chǎng)在免疫背景不明的情況下，可使用布病平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)（競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)）篩選，結(jié)合布病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的方法、熒光偏振試驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀進(jìn)行綜合鑒別診斷，陽性個(gè)體可視為野毒感染牛[3-4]。

3小結(jié)

奶牛布病是影響較大的人畜共患病，同時(shí)嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全，為此國(guó)家提出了凈化措施。作為基層工作者，為有效推進(jìn)國(guó)家政策的實(shí)施，同時(shí)避免養(yǎng)殖場(chǎng)戶的損失，探索簡(jiǎn)便實(shí)用的鑒別診斷技術(shù)具有重要意義。今后我們將繼續(xù)在實(shí)際工作中積累發(fā)現(xiàn)好的技術(shù)方法，以有效推廣應(yīng)用。

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