一例鴨腺病毒病的診斷

摘要：禽腺病毒感染在家禽中廣泛存在，鴨群作為腺病毒的天然貯存宿主，近年來感染率不斷上升，其中鴨3型腺病毒（DAdV-3）為近年來新發的以引起鴨肝臟腫大、發黃、質地變脆、壞死、呈彌散性出血；腎臟腫大、大面積出血點為特征的鴨群新發疫病。DAdV-3會引起雛番鴨發病和死亡，造成疫病流行，嚴重危害養殖業生產。本文就一例感染DAdV-3病鴨的診斷進行詳細的描述和探討。首先利用剖檢的方法觀察病鴨的大體病變，同時采集病料，制作組織切片進行鏡檢觀察。然后利用細胞接種的方法獲得病毒液，提取病毒DNA。利用PCR實驗的方法對禽腺病毒特定DNA片段進行擴增，結果顯示擴增條帶與標準DAdV-3條帶大小相似，接種細胞可見細胞變圓、團聚、空泡化現象，表明該疾病為鴨腺病毒病。該論文服務于進一步的科研分析，為深入探究鴨腺病毒病的致病機理打下基礎。

關鍵詞：鴨腺病毒；DAdV-3；診斷；組織切片；PCR實驗

近年，在我國的鴨鵝養殖場等水禽養殖密集區域鴨3型腺病毒（duck adenovirus type 3，DAdV-3）感染流行較為嚴重，并且發病較為普遍，本病潛伏期短，發病較快，死亡率60%～70%，有繼發感染時發病率會更高，并且由于粗放的養殖管理模式，導致部分鴨場連續2～3批持續發病，對當地養鴨業造成嚴重危害。目前DAdV-3的抗原檢測方法主要依賴PCR和DNA測序。本實驗通過描述一例DAdV-3感染病鴨的診斷過程，總結DAdV-3的診斷要點，服務于臨床診療和疾病預防，也為深入探究鴨腺病毒病的致病機理打下基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品

來自江蘇省某養殖場的病死鴨，為27日齡的白番鴨。該鴨發病初期出現精神沉郁、飲食量減少、拉稀，糞便呈白色。隨著病程發展，患病鴨精神高度萎靡、食欲廢絕，疑似感染DAdV-3死亡。

1.2 主要試劑

10%甲醛溶液、4%甲醛溶液、不同梯度濃度乙醇溶液（70%、80%、90%、100%）、二甲苯溶液、蘇木精-伊紅染色液、病毒和病原體核酸分離提取試劑盒、PCR擴增試劑Dream-Taq Green PCR Master Mix（2×）、瓊脂糖粉、核酸染料、電泳液。

1.3 方法

1）病鴨剖檢觀察。①外部檢查。檢查病死鴨的健康狀況；觀察羽毛是否臟亂，光澤度如何，有無脫毛現象；天然孔有無分泌物流出，分泌物有無異常情況；可視黏膜是否存在發紺、出血、黃染等情況；泄殖腔附近是否被糞便污染，糞便的顏色，性狀有無異常；皮膚有無結痂、出血等現象；四肢關節有無膿腫等異常。②皮下檢查。將病鴨放置于水中浸濕，然后將尸體仰放于實驗盤。剪開兩腿與腹部的皮膚連接，用力按壓兩腿使髖關節脫臼，從剪開處沿著胸骨兩側剪至鎖骨，向上掀開胸腹部皮膚，直至頭頸部。觀察皮下脂肪含量、色澤，血管狀況，有無充血、出血等。③體腔器官檢查。用剪刀沿胸骨兩側剪至鎖骨，向上掀開胸骨，使體腔暴露。剖開體腔后，觀察各臟器的位置是否正常，腹腔和胸腔有無積液，臟器之間有無粘連等情況，隨后按照一定的順序依次取出各個臟器放置于實驗盤中，分別檢查肝臟、脾臟、心臟、胃腸道、肺、腎臟、生殖器官、口腔和頸部器官、腦有無出血腫大病變。④病料采集與處理。體腔開啟后無菌采集肝臟病健交界處，2mm均勻大小，置于滅菌容器內。一部分病料于-70℃凍存用于病毒分離，另一部分病料轉移到10%甲醛溶液中浸泡48h，每4h沖水30min沖去甲醛，更換浸泡液。

2）病理切片的制作。修剪處理好的病料，取最明顯的病健交界處，放置于浸蠟框中標記送檢材料。將浸蠟框依次放入從低到高梯度的乙醇中脫水：70%乙醇中放置4h；80%乙醇中放置4h；90%乙醇中放置4h；100%乙醇（Ⅰ）和100%乙醇（Ⅱ）中一共放置2h。

脫水后利用二甲苯透明：浸蠟框浸于二甲苯（Ⅰ）中1.5min，二甲苯（Ⅱ）中1.5min，期間隨時取出組織查看，通過觀察組織邊緣的透光度來實時調整浸泡時間。

將浸蠟框浸于蠟液中2h（56～58℃）。取出浸蠟框后，將蠟液倒入包埋框中，將組織放入蠟液，輕輕壓一壓組織排出氣泡，插入標簽后凍硬。

使用切片機將凍硬的蠟塊切片（2～5μm厚度），在水中展開，挑選完整的切片在40℃的水中燙片，用載玻片垂直撈起，56～58℃烘片4h左右。

利用二甲苯脫蠟：將載玻片浸于二甲苯（Ⅰ）中10min，二甲苯（Ⅱ）中10min，再按照濃度從高到低浸于乙醇中脫去二甲苯：100%乙醇中浸泡3min；95%乙醇中浸泡1min；90%乙醇中浸泡1min；85%乙醇中浸泡1min；80%乙醇中浸泡1min；75%乙醇中浸泡1min，水洗。

在載玻片上滴入幾滴蘇木素，使組織完全被覆蓋，染色10min，可將組織細胞核染為藍紫色，在鹽酸酒精中浸泡1s去除蘇木素雜質，水洗。促藍液返藍1s用以分色，水洗。伊紅染色1～5s將細胞質染為紅色，水洗。依次浸于濃度從低到高的乙醇中（75%、80%、85%、90%、95%、100%），再依次浸泡于二甲苯（Ⅰ）和二甲苯（Ⅱ）中2～3s，水洗，晾干。最后用中性樹脂封片，使用顯微鏡鏡檢。

3）病毒增殖與分離。①樣本處理。將經過無菌采集和保存的病鴨肝臟樣本，剪碎后仔細研磨，2倍PBS溶液稀釋后制成一定量的勻漿，加入1，500～2，000IU的青霉素和鏈霉素進行滅菌處理，反復低溫冷凍溶解3次，4℃、6，000r/min離心10min，取出來的上清液即為樣本處理液[1]。②分離培養。鴨3型腺病毒在雞肝臟細胞上生長良好，因此可用來培養DAdV-3。將樣本處理液接種雞肝細胞系（LMH），接種量為200μL。感染后3～4d，出現細胞變圓、團聚、空泡化現象，最明顯的表現是許多病變細胞聚集在一起呈葡萄串狀，對照未感染細胞生長正常（如圖1、圖2所示）。③病毒DNA的提取。本次實驗使用購自北京厚生博泰科技有限公司的病毒基因組DNA提取試劑盒。取雞肝細胞培養DAdV-3后獲得的細胞上清液250μL置于離心管中，放入離心機10，000r/min離心5min，用移液器吸取上層清液200μL于EP管中。在EP管中加入200μL雞肝細胞培養DAdV-3所獲得的細胞上清液、20μL試劑盒中所提供的Proteinase K溶液及200μL的Buffer G溶液置于漩渦振蕩器上20s混勻。置于恒溫箱中56～58℃靜置，然后在放入離心機中5，000r/min離心1min，靜置等待溶液集中。加入200μL的Ethanol absolute，振蕩20s置于離心機中5，000r/min離心1min，靜置等待溶液集中。

將一個核酸純化柱放在2mL的PE管中，用移液器將溶液吸至核酸純化柱，10，000r/min離心40s，棄去多余液體。吸取550μL的Buffer GD于核酸純化柱中，10，000r/min離心40s，棄去多余液體。吸取550μL的Buffer PW于核酸純化柱中，10，000r/min離心40s，棄去多余液體。吸取550μL的Ethanol absolute于核酸純化柱中，10，000r/min離心40s，PE管中液體傾去。把核酸純化柱放回PE管，置于離心機中10，000r/min，3min除去多余液體。將核酸純化柱放進1.5mL新PE管中，打開核酸純化柱常溫靜置5min，待表面膜干透后加入50μL的Spent regenerant，靜置3min左右，置于離心機中10，000r/min離心1min，PE管底部即為病毒DNA，檢測核酸濃度是否達標后置于冰箱-20℃冷凍保存[2]。

4）PCR檢測。將提取的病毒DNA進行PCR擴增。引物序列：鴨腺3病毒DAdV3-450F：ATGCTCTGTCCGTTTAGATTCATCCAG；鴨腺3病毒DAdV3-450R：CTTAACCCCAACTGACTGCCCATCAGT。

PCR反應條件：94℃ 5min；94℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 1min；72℃ 10min；4℃；35cycles。

對應引物終濃度0.4μmol/L，模板DNA 1μL，ddH2O 20μL。

5）瓊脂糖凝膠電泳。1%瓊脂糖凝膠的制備：將稱量紙置于電子秤上稱取0.5g的瓊脂糖粉末傾倒于燒杯里，加入50g的1倍TAE緩沖液（實驗室自備），用玻璃棒攪拌均勻，隨后使用微波爐煮沸，取出待其稍微冷卻，再重復步驟直到粉末完全溶解。

膠板的制作：將電泳板清洗干凈，特別注意槽內角落認真清潔，晾干。將制膠板卡入電泳槽兩端卡扣固定好。將1%的瓊脂糖凝膠冷卻到合適溫度傾倒于電泳板中，使其均勻鋪開。插入梳子，在室溫下冷卻，待瓊脂糖凝膠凝固后，拔出梳子形成樣品槽。倒入1倍的TAE溶液沒過泳道。

加樣：用移液器分別吸取陽性對照、陰性對照，待檢樣本DNA（與緩沖液混合10倍稀釋）各10μL到對應的樣品槽。

電泳：將制成的電泳板放置于電泳儀器的電泳液中，打開儀器開始工作。Us=91V，Is=460mA，Ts=1.05h。

電泳儀工作結束后小心拿出電泳板，將凝膠倒出，用核酸染料染色約15min，清水沖洗。最后用電泳凝膠成像分析系統觀察。

2 結果與分析

2.1 剖檢病變觀察

病死鴨羽毛松亂，無脫毛現象；皮膚無腫脹出血；天然孔無分泌物流出；泄殖腔周圍羽毛有糞便污染，呈白色稀糞；皮下脂肪無充血出血；肝臟顯著腫大、發黃、質地變脆、壞死、呈彌散性出血（如圖3所示）；腎臟腫大出血（如圖4所示）；其余臟器無明顯肉眼可見病變。

2.2 顯微病變觀察

將HE染色的肝臟切片進行組織病理學觀察可見肝臟出血，肝細胞發生廣泛的嚴重水腫。肝小葉內可見壞死灶、出血和膽汁滯留，壞死灶呈不規則島嶼狀或團塊狀，肝細胞結節狀再生和纖維結締組織廣泛增生。肝實質發生明顯變性壞死，間質結締組織增生。巨噬細胞、淋巴細胞顯著浸潤，枯否氏細胞、肝竇皮細胞肥大、增生，匯管區膽管和間質結締組織增生。在細胞核內呈現嗜堿性包涵體（如圖5，圖6所示）。

2.3 PCR檢測結果

如圖7所示，從左至右，第1泳道為陽性對照（標準DAdV-3提取的DNA），第2泳道為陰性對照，1為待測樣本DNA。陽性對照與病料樣本均出現明顯的條帶，而陰性對照無顯示，說明擴增整體效果很好。樣品1出現了目的條帶（大小約450bp）與標準陽性對照相似，所以表明病料中均含有DAdV-3核酸。

3 討論與小結

鴨3型腺病毒病是近來年新出現的一種主要感染番鴨的傳染病，在我國多個省份均有發現該病，給禽類養殖業造成了巨大損失。此次根據臨床癥狀、剖檢病變、病理組織學檢查及分子生物學檢測結果，診斷了一例感染DAdV-3的病鴨，確定該發病番鴨為鴨腺病毒3型（DAdV-3）感染。由此總結出該病的診斷要點，希望對其預防帶來幫助。

DAdV-3感染的病鴨發病之初常常表現為精神狀況不良、飲食量減少、拉稀，糞便呈白色。隨著病情發展，患病鴨精神高度萎靡、食欲廢絕。剖檢后臟器的病變主要在肝臟和腎臟，肝臟顯著腫大、出血、顏色發黃、質地變脆、表面分布有大小不一的壞死灶；腎臟腫大、有出血點或出血斑，其余臟器無明顯肉眼可見病變。病理組織學可觀察到肝細胞細胞核內存在包涵體，以“包涵體肝炎”為特征。確診可通過分子生物學實驗來實現：使用PCR檢測核酸，與標準DAdV-3提取的DNA對比，觀察條帶大小是否相同。

DAdV-3感染與鴨病毒性肝炎、禽呼腸孤病毒病感染表現的癥狀有相似之處，都可表現為肝炎、肝臟出血腫大，在實際臨床中亦需注意鑒別診斷。DAdV-3感染會引起肝臟顏色發黃、表面有大小不一的壞死灶，而鴨病毒性肝炎、禽呼腸孤病毒病感染正常不會出現這種病變，由此臨床實踐中可做初步區分。

對于禽類養殖企業或散養戶來說，如果出現部分鴨只突然死亡的情況應立即送到專業機構確診，避免出現鴨群大范圍感染。腺病毒有良好的免疫原性，只要科學接種，定期檢測抗體水平就可以產生很好的預防效果。雛鴨應于6～8日齡接種滅活疫苗，種鴨應在生產前30和15d分別接種滅活疫苗。場區應做好生物安全舉措，嚴格雛鴨的引進渠道，不從有流行病傳播的地區引進雛鴨；設置生產區和隔離區，對于已經發病的鴨只應及時隔離，避免疫病更大范圍的流行；對于病死鴨應及時無害化處理。場區可使用戊二醛、甲醛等醛類消毒劑效果明顯。嚴格人員、器具消毒管理，做好糞便管理工作，全進全出，避免疾病的水平傳播。

通過接種對應病毒型的高免血清或高免卵黃抗體可治療已經發病的鴨只。感染腺病毒往往會導致免疫力下降，出現其他部位感染，此時可使用非甾體類抗炎藥或頭孢菌素治療，但應控制使用次數，以免增加肝臟負擔，對腺病毒的治療產生不利因素。同時可補充維生素增強病鴨體質。

除此之外也可用中藥輔助治療，如板藍根顆粒、麻杏石甘口服液等在臨床上被廣泛地用于治療腺病毒引起的表癥，可以起到清熱解毒、消炎抗菌的功效，治療效果比較突出。

參考文獻：

[1] 武鴻，康亞男，唐榮宏，等.3株櫻桃谷肉鴨源和2株番鴨源新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J].南京農業大學學報，2019，42（2）：328-335.

[2] 單戰海.Gadd45影響細胞遷移及侵襲能力的功能及機制研究[D].中南大學，2013.