中藥微生態制劑在TMR保鮮及預防奶牛乳房炎中的應用

摘要：為了防止全混合日糧發生霉變產生霉菌毒素，提高飼料的有氧穩定性和貯存時間，同時有效預防奶牛隱性乳房炎的發生，本研究以金銀花粉末、葡萄酒酒糟和葡萄糖為發酵培養基，接種費氏丙酸桿菌與枯草芽孢桿菌，發酵液離心取上清液，濃縮滅菌后得到中藥微生態制劑。將該中藥微生態制劑添加到全混合日糧（TMR）中進行有氧穩定性試驗，分別在0、5、10、15和20 d對TMR中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素及赭曲霉毒素含量進行測定，并進行奶牛飼喂試驗測定產奶量、體細胞數、乳蛋白率和乳脂率指標。結果表明，添加中藥微生態制劑的TMR在20天內有效地抑制霉菌毒素的生成，顯著增加了TMR有氧穩定性；并且通過對泌乳奶牛20d的飼喂試驗，試驗組牛奶中體細胞數量平均降低了72%，平均產奶量、乳脂率和乳蛋白率都有顯著提高。結論：本研究制備的中藥微生態制劑具有良好的飼料保鮮效果，明顯提高了TMR有氧穩定性，并能有效預防奶牛乳房炎，改善乳品質。

關鍵詞：全混合日糧；微生態制劑；金銀花；霉菌毒素；奶牛乳腺炎

全混合日糧（ total mixed ration，TMR） 興起于上世紀五六十年代，是將粗料、精料補充料、礦物質、維生素和其他添加劑充分混合，配制成奶牛所需各種營養物質的全價飼料[1-2]。近年來這種先進的喂養技術也普遍應用于國內很多大型奶牛養殖場。TMR有眾多優點，各種飼料的混合能夠均衡配比，增加奶牛干物質的采食量，避免瘤胃pH的突然下降；飼料得到混合充分，還能排除奶牛對某一特殊飼料的挑食；根據奶牛各生長發育階段營養需要的不同進行TMR配制，在不降低其生產力的前提下，充分利用當地的秸稈、酒糟等農副產品，盡量配制最低成本日糧[2-3]。

在TMR配制過程中，因為飼養規模和飼料用量較大，一般會配制大量的TMR日糧進行儲存放置，TMR日糧在儲存過程中容易發酵，引起飼料溫度上升、適口性變差、干物質降低，各種好氧細菌細菌、霉菌滋生，產生各類霉菌毒素，導致TMR日糧的安全性和穩定性下降。一般從三個方面來抑制TMR日糧發酵：添加飼料防腐劑、選用優質青貯飼料和對TMR運輸車輛的及時清理消毒[4]。目前飼料中常用的防腐劑包括有機酸、非蛋白氮（氨或尿素）和微生物制劑。TMR保鮮劑主要以醋酸、雙乙酸鈉、山梨酸、丙酸鹽等有機酸為主，但有機酸容易與飼料中的其他組分發生反應，造成飼料適口性下降，且此類保鮮劑功能單一[5]。因此越來越多的學者對微生物菌劑、抗菌肽等生物保鮮劑進行研究，以期在提高TMR的儲存時間，保證飼料的安全性和穩定性的同時，能夠具備防治奶牛乳房炎、提高奶牛免疫力等其他功能[6]。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

1）菌種" 費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CICC 10019；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No.15646。

2）試劑 紅葡萄酒酒糟，購自泰安市東岳泰山葡萄酒廠；黃曲霉毒素B1（AFB1）ELISA檢測試劑盒購自上海科順生物科技有限公司；赭曲霉毒素（OTA）ELISA檢測試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司，玉米赤霉烯酮（ZEN）毒素多參數定量檢測試劑盒（上轉發光法）、嘔吐毒素（DON）多參數定量檢測試劑盒（上轉發光法）購自北京熱景生物技術股份有限公司。

3）設備 Bio-Radimark酶標儀，美國伯樂生產；上轉發光免疫分析儀，北京熱景生物技術有限公司生產；全自動細胞記數儀，賽默飛生產；FT-120乳成分分析儀，福斯華（北京）科貿有限公司。其它設備均由本公司研發中心提供。

1.2" 試驗方法

1）中藥微生態制劑的制備

發酵培養基組成：滅菌葡萄酒酒糟（110℃下滅菌5min）6kg，金銀花粉末（含水量≤10%，粉碎至30目）1kg，質量分數為60%的葡萄糖溶液0.2kg。

向發酵培養基中添加72g費氏丙酸桿菌和288g枯草芽孢桿菌菌粉，37℃下發酵48h，發酵產物進行離心（1000rpm，15min），取上清液濃縮至原體積的1/3，121℃下滅菌1min得到中藥微生態制劑。

2）TMR穩定性和霉菌毒素測定試驗

①TMR制備 本試驗分為對照組與試驗組，按照表1的組分配置TMR（組成見表1），每組10kg，每組做3次平行。試驗組噴灑TMR重量5%的中藥微生態制劑，空白對照組添加等量蒸餾水，然后將各組TMR裝入飼料袋中。

②TMR溫度測定 每組TMR飼料袋中由上至下等間隔插入3枚測溫芯片，保證每個飼料袋中測溫芯片的位置大體相同。將各組TMR日糧置于恒溫恒濕（25℃，40%RH）培養箱中，每4h記錄一次溫度，共監測20d，計算平均溫度。

③TMR中霉菌毒素的檢測 將置于恒溫恒濕（25℃，40%RH）培養箱中的TMR分別在第0、5、10、15、20天進行觀察取樣，分別采用酶聯免疫法和上轉發光法對上述TMR中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素及赭曲霉毒素含量進行檢測。

3）中藥微生態制劑防治奶牛乳房炎的試驗

在泰安本地奶牛養殖戶中，挑選20頭患有隱性乳房炎的荷斯坦奶牛（應用CMT進行診斷，乳汁中體細胞數大于50萬/mL），按照體細胞數、體重、產奶量大致均等分為2組，試驗組飼喂添加5%中藥微生態制劑的TMR，對照組飼喂噴灑等量蒸餾水的TMR。另外選取健康的荷斯坦奶牛10頭，健康組同樣飼喂添加5%中藥微生態制劑的TMR[7]。

預試期為5d，正試期為15d，每天記錄產奶量并計算平均值，分別在試驗開始和試驗結束取混合奶樣，用特制的加有防腐劑的取樣瓶分別于早中晚采集奶樣，所取奶樣總量約為40mL（早中晚比例約為4：3：3），對牛奶中的體細胞數、乳脂率、乳蛋白率進行測定[8]。

4）數據統計分析

先通過Excel2010整理數據計算平均值與標準差，再應用SPSS26.0統計軟件，對試驗數據進行單因素方差分析（ANOVA）和組間多重比較（Duncan's）。

2 結果

2.1 TMR溫度測定結果

由表2可以看出，試驗組TMR的平均溫度遠低于對照組，試驗組TMR顏色變化不大，無結塊無異味，而對照組TMR顏色變深，開始發霉結塊，產生異味，說明添加中藥微生態制劑的TMR不易腐敗變質，有氧穩定性好。

2.2 TMR中霉菌毒素的檢測

參照GB13087—2017飼料衛生標準[9]，由表3可知，在20d內試驗組與對照組TMR中AFB1、ZEN、DON和OTA含量呈上升趨勢，添加中藥微生態制劑的試驗組TMR在20d內各項霉菌毒素含量均未超過國家標準，與對照組有顯著差異（p＜0.05），對照組TMR的AFB1含量在10d已經超標，在20d后ZEN、OTA含量均已超標，DON含量已接近限量標準。以上數據表明，本研究的中藥微生態制劑具有顯著抑制TMR日糧中霉菌毒素生成的作用，能夠延長TMR的有氧穩定性。

2.3 中藥微生態制劑防治奶牛乳房炎的實驗結果

由表4表5可知，在飼喂試驗組TMR日糧20d后，試驗組奶牛的體細胞數顯著降低（p＜0.05），平均降低了72%左右，產奶量、乳脂率和乳蛋白率顯著上升（p＜0.05），健康組的產奶量與體細胞數變化不明顯，乳脂率和乳蛋白率較飼喂前有顯著上升，對照組各指標無顯著變化，體細胞數仍在較高水平。結果表明TMR中添加中藥微生態制劑能夠有效防治奶牛乳房炎，降低牛奶中體細胞水平，改善牛奶品質。

3 討論

近年來微生物制劑應用于飼料防腐的研究較多，沈凌宏等[10]總結了抗菌肽作為生物防腐劑的研究進展，其熱穩定性好，分子量小，具有廣譜抗菌的特點，是動物飼料理想的防腐劑替代品。美國T·卡內佐斯等人[11]發明了一種噬菌體動物飼料防腐劑，該防腐劑在被動物攝入之前保持無活性形式，攝入后對可能污染飼料產品的致病菌，如沙門氏菌、大腸桿菌、彎曲桿菌或梭菌具有特異性裂解活性。

同時越來越多的研究表明中草藥以及微生物制劑在飼料中添加能夠提高奶牛產奶性能，預防奶牛乳房炎等，因此逐步應用于飼料添加劑領域[12]。金碩等[13]采用多種中草藥、酵母菌、酵母細胞壁、嗜酸乳桿菌等飼料添加劑飼喂奶牛，試驗結束后奶牛隱性乳房炎發病率顯著降低，產奶量極顯著升高，提高了奶牛的泌乳性能；艾日登才次克等[14]采用復合乳酸菌微生態制劑（含有干酪乳桿菌和植物乳桿菌），協調瘤胃的動態平衡，減少有害菌對瘤胃損傷，降低牛奶中體細胞數，穩定奶產量；張江等[8]在日糧中添加主要成分為枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、釀酒酵母及天蠶素抗菌肽的生物添加劑，添加30g/d·頭可提高奶牛平均產奶量1.5kg/d·頭，體細胞降幅達60%，具有巨大的經濟效益；寨鴻瑞等[15]用乙醇溶液提取中藥有效成分，接種乳酸桿菌、紅茶菌和酵母菌，制備中藥微生態制劑，對奶牛隱性乳房炎有良好的治療效果；張秉勝等[16]在泌乳奶牛日糧中添加枯草芽孢桿菌，可以提高奶牛泌乳量，改善乳品質，提高奶牛免疫力，減少乳房炎患病幾率。

本研究制備的中藥微生態制劑，是以金銀花粉末、葡萄酒酒糟、葡萄糖為發酵培養基，接種費氏丙酸桿菌和枯草芽孢桿菌，發酵液離心取上清液，濃縮滅菌后得到的。該中藥微生態制劑添加到TMR中，在20d內能夠有效抑制霉菌毒素的生成，提高TMR的有氧穩定性，同時還可以有效防治奶牛乳房炎，提高產奶量，改善乳品質，降低奶牛飼喂成本。

參考文獻：

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