山羊口瘡病感染的診斷報告

摘要：2022年3月，四川省西昌市某鄉鎮山羊發生了口唇病變為特征的疾病。采集患病山羊的口腔分泌物及口瘡黏液提取總DNA并進行PCR擴增及測序分析確診該羊場感染了羊口瘡病毒。這是西昌省首次檢測到并報道羊口瘡病，可為西昌市做好該病的防控和公共衛生安全提供一定的參考。

關鍵詞：山羊；PCR擴增；測序分析；羊口瘡病毒

羊傳染性膿皰病（contagious ecthyma， CE）即傳染性膿皰性皮炎（contagious pustulor dermatiris， CPD），俗名羊口瘡，是由痘病毒科（poxviridae ）副痘病毒屬（parachavovirus）的羊傳染性膿皰病病毒（orf virus，ORFV）感染導致的山羊、綿羊等小型反芻動物及人的人畜共患病[1-2]。其特征是引起動物的特征性損傷，造成皮膚、黏膜和器官上的丘疹、水皰、膿皰和結痂等癥狀[3]。該病對山羊感染率高，致死率低，但當繼發或混感其它病原后，則可導致較高死亡率[3]。ORFV是一個135kb大小的線狀雙鏈DNA分子，包含130多種基因，編碼幾十種蛋白，有16個開放閱讀框[4]。B2L基因是ORFV的結構基因，全長1，137bp，編碼約42 ku的蛋白質，是該病毒的主要囊膜成分之一[3]，也是該病毒的保護性抗原，同時不同分離毒株的B2L基因的保守性高[5]，因此其常被用于ORFV分子生物學診斷和遺傳進化分析。本研究從四川省西昌某發病羊場的病料中擴增獲得ORFV，確診發病山羊為ORFV感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1）病料" 采自四川省西昌市發病山羊口腔棉拭子和口瘡黏液，共10個樣本。

2）主要試劑與儀器" DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、Cycle-pure kit試劑盒均購自生工生物工程（上海）有限公司；普通PCR儀、核酸蛋白電泳儀、凝膠成像系統VersaDoc2000均購自Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1）核酸的提取" 將采集的體表樣品剪碎，嚴格按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，提取的DNA放置于-20℃備用。

2） PCR檢測" 運用已成功建立的ORFV的PCR檢測方法[6]對提取樣本總DNA進行擴增，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。分別對10個樣品的總DNA進行PCR擴增，PCR產物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結果；對強陽性的PCR擴增產物進行純化并送至生工生物工程（上海）有限公司測序。

3）序列測定及比較分析" 將測序結果與NCBI上已公布的ORFV基因序列進行比對分析。再利用DNAstar中MegAlign程序對測序的陽性樣本基因組序列與GenBank中ORFV參考毒株序列進行核苷酸和氨基酸同源性分析；用系統進化樹MAGA7軟件進行遺傳進化分析，采用Neighbor-Joining（NJ）法生成系統進化樹。

2 結果

2.1 臨床癥狀和發病情況

2022年3月，四川省西昌市某鄉鎮相鄰的兩戶散養戶共飼養建昌黑山羊102只，患病山羊表現為口角、上唇、鼻鏡出現丘疹、水泡、膿皰、結痂相互融合的癥狀，個別波及整個口唇周圍，出現大面積龜裂后形成污穢結痂，結痂下有肉芽組織增生，個別因結痂增厚使整個嘴唇腫大外翻，出現桑葚狀樣隆起為特征的疾病（圖1）。在本次病例中各個年齡段的山羊均有患病，患病羊34只，發病率高達33.33%。

2.2 PCR檢測

PCR擴增產物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果顯示擴增片段約為500bp，與預期的540bp相一致（圖2）。將強陽性樣本的PCR擴增產物進行純化后送生工生物工程（上海）有限公司測序。

2.3 測序結果分析

將測序結果與GenBank中收錄的ORFV基因序列進行序列比對，結果發現，該分離株的B2L基因與其他毒株的核苷酸同源性均在98%以上，確定擴增的片段為ORFV的基因組片段，同時表明該羊場的患病山羊是被ORFV感染引起的。陽性樣本（H11）基因組核苷酸序列長度為540bp，與國內21株參考序列的核苷酸同源性為95.5%～98.7%，氨基酸同源性為90.2%～97.8%，其中與2012年和2013年的福建毒株（KP010353和KC568399）同源性最高，與國內的綿羊毒株（JQ904799、JN565694和HQ694772）同源性最低；與國外5株參考毒株的核苷酸同源性為96.5%～97.3%，氨基酸同源性為93.4%～95.1%。與我國的疫苗毒株的核苷酸和氨基酸同源性分別為97.6%、94.5%（圖3）。

為了進一步確定該毒株與國內外已發表的參考毒株之間的遺傳進化關系，運用MEGA7生物學軟件的鄰近法基于ORFV B2L基因構建系統進化樹。從核苷酸系統進化樹中可以看出（圖4），選用的參考毒株被分為2個大支，國內的綿羊毒株主要與國外的毒株分布為一支，而本次的實驗毒株（H11）與國內的山羊毒株為一大支，并且與福建的山羊毒株聚在一小分支上，因此實驗毒株（H11）與FJ-XY株（KC568399）的親緣關系最近。

3 討論

本試驗根據送檢病羊所表現的典型臨床癥狀，初步診斷為ORF。為進一步進行確診，通過運用PCR方法檢測和B2L基因組測序結果比對分析，表明送檢病料為ORFV陽性，證實了該起病例為ORFV感染所致，該研究為西昌市做好ORF的診斷和防控提供一定的參考。

ORFV屬于痘病毒科副痘病毒屬成員中的一員，是該屬成員中最小的病毒，與其同屬的成員還有新西蘭馬鹿副痘病毒（parapox virus of reddeer in New Zealand， PVNZ）、偽牛痘病毒（pseudo cow pox virus， PCPV）、牛丘疹性口炎病毒（bovine popular stomatitis virus， BPSV）[1-2，7]。在世界范圍內都有關于該病大流行的記載，該病多發于春季和秋季，易感動物在各個年齡階段均能感染此病，但幼齡動物易感且死亡率較高[4-6]。山羊和綿羊為ORFV的天然宿主，除此之外該病毒還感染羚羊、駱駝、紅鹿等反芻動物以及貓、狗甚至人等[7-8]。ORFV傳染性強、發病率高、致死率低，發病率可達90%，羔羊最易感，值得關注的是，該病能導致動物采食困難，機體虛弱、免疫力低下，可由于繼發感染導致死亡，這給世界各地的養羊業帶來了巨大的經濟損失。目前針對ORF無特效藥，疫苗接種是控制ORF暴發和流行的最好方法，但目前滅活疫苗的保護效果較差，而弱毒疫苗又存在毒力返強和病毒擴散的風險[8]，且各地區流行毒株也不相同，進而大大增加了ORF的防控難度。

該起病例羊群均按照正常免疫程序進行管理，但由于該地位于西昌市2，300m海拔的山區，養殖多以半放牧式飼養，消毒很難到位，極易造成病毒在大環境中存活和傳播，這無疑給當地的羊養殖業留下了飼養管理安全隱患。經臨床和實驗室診斷確診為ORF后，立即將患病山羊進行隔離治療，并對患病山羊接觸的大環境進行徹底清洗、消毒。同時由于放牧飼養存日糧搭配不科學的現象，因此治療期間不僅要做好對癥治療，更應該按照防止繼發感染和抗病毒的原則進行羊群大范圍的補充微量元素[9]，以提高羊群免疫力和抗應激能力。

本研究不僅對患病山羊的病因做出了明確的診斷結果，同時對該病例進行了基因組測序和序列分析，從系統進化樹和同源性分析表明，目前國內的ORFV毒株地域差異明顯，但本次研究中的毒株卻與福建的毒株較為接近，近幾年雙方之間又無引種記錄，這將值得我們進一步對該區域的ORFV的流行病學、分子特征及致病機制進行探究。

參考文獻：

[1] 張雪.羊口瘡病毒單抗2E4可變區同源建模及病毒B2L基因體外編輯的研究[D].黑龍江八一農墾大學，2017.

[2] 張大俊，盧炳州，閆鳴昊，等.羊傳染性膿皰病毒疫苗株和野毒株GIF基因比較分析[J].畜牧與獸醫， 2020，52（3）：91-96.

[3] 毛從劍，張興民，黃忍，等.口瘡病毒四川流行株的分離鑒定及其遺傳進化分析[J].中國獸醫科學，2019，49（7）：871-878.

[4] 沙娜瓦爾·塔希，王文，馬偉，等.新疆南疆地區羊口瘡病毒的分離鑒定及其遺傳進化分析[J].草食家畜，2018（1）：26-32.

[5] 魯燕.羊傳染性膿皰病毒GIF基因的克隆及序列分析[D].內蒙古農業大學，2012.

[6] 李前瑞.羊口瘡病毒PCR檢測方法的建立與應用[D].西北農林科技大學，2013.

[7] 丁學東，王國華，潘相臣，等.羊源與駱駝源羊口瘡病毒免疫相關基因的比較分析[J].中國畜牧獸醫，2020，47（12）：3815-3824.

[8] 徐夢實.羊傳染性膿皰病毒002/121雙基因缺失株的構建及其免疫效果評價[D].吉林大學，2020.

[9] 吳雅清，焦玉蘭，劉浩，等.一例羊口瘡病的診斷與防控[J].中國動物保健，2022，24（5）：111-112+119.