Kartogenin誘導兔關節液來源間充質干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究

【摘要】目的 探究兔關節液來源間充質干細胞在Kartogenin（KGN）的誘導下向軟骨細胞分化的效果。方法 選擇100只符合研究要求的新西蘭大白兔，隨機分為低濃度組（KGN濃度為1 μmol/L）、中濃度組（KGN濃度為5 μmol/L）、高濃度組（KGN濃度為10 μmol/L）及對照組（KGN濃度為0 μmol/L）。對比分析各組Ⅱ型膠原蛋白染色陽性面積占比、成軟骨分化標志基因的表達水平和成軟骨細胞數量。結果 中濃度組Ⅱ型膠原蛋白染色陽性面積占比均顯著高于低濃度組、高濃度組和對照組，差異均有統計學意義（均Plt;0.05）。中濃度組COL2A1、SOX9和ACAN的表達水平均顯著高于低濃度組、高濃度組和對照組，差異均有統計學意義（均Plt;0.05）。中濃度組成軟骨細胞數量均顯著高于低濃度組、高濃度組和對照組，差異均有統計學意義（均Plt;0.05）。結論 KGN能誘導關節液來源間充質干細胞向軟骨細胞分化，其中濃度為5 μmol/L的作用最明顯。

【關鍵詞】Kartogenin；關節液；間充質干細胞；軟骨細胞

中圖分類號：R684.3 文獻標識碼：A 文章編號：2096-2665.2023.8.0.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.08.039

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是最常見的慢性關節疾病，發病率隨年齡增長而增加，是導致老年人行動能力受損的主要肌肉骨骼原因。研究發現[1]，骨性關節炎的特點是細胞外基質的丟失和關節軟骨的破壞。OA主要影響膝、手、臀部和脊柱等關節，雖然已經提出了一些與OA相關的危險因素，包括遺傳易感、衰老、肥胖和關節錯位等，但OA的發病機制在很大程度上仍不明確。骨關節炎患者臨床表現包括慢性疼痛、關節不穩、關節僵硬、關節畸形，影像學可見關節間隙狹窄，治療目的以減輕疼痛、減少僵硬、維持功能能力和提高生活質量為主。骨關節炎患者的間充質細胞是處于正常狀態的，可以被抽吸培養并自體移植。多項研究表明[2-3]，通過生物干預，包括間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、生物生長因子或其他組織工程方法，關節軟骨病變可在體外或體內有效再生。盡管利用間充質干細胞（MSCs）的組織工程器官策略是一個修復氣管狹窄的成功選擇，但其臨床應用目前仍存在爭議。MSCs的體外成軟骨分化依賴于外源性誘導因子，如TGF-β和骨形態發生蛋白家族成員，可在培養微環境中補充。Kartogenin（KGN）是一種小的雜環分子，可以促進人骨髓間充質干細胞向成軟骨細胞分化，表現出軟骨保護作用。KGN是人間充質干細胞分化為軟骨細胞的誘導劑，半最大效應濃度（EC50）值為100 nmol/L。KGN結合纖維蛋白A，破壞其與轉錄因子核心結合因子β亞基（CBFβ）的相互作用，并通過調節CBFβ-RUNX1轉錄程序來誘導軟骨形成。研究發現，KGN可以有效促進間充質干細胞特異性分化為軟骨細胞[4]。本研究對兔關節液來源間充質干細胞進行KGN預處理，主要目的是研究KGN促進MSCs向軟骨細胞分化的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 取新西蘭大白兔（2.5～3.0 kg，6月齡）100只用于實驗研究，購自中國醫學科學院動物所，飼養環境為室溫，相對濕度為50%～60%RH，12 h光照與12 h黑夜交替。每天正常自由飲水、進食并保持正?；顒?，待大白兔適應環境1周后開始試驗。該研究遵循國家研究委員會《實驗室動物護理和使用指南》中的原則。本研究已經通過華中科技大學協和深圳醫院醫學倫理審批并獲得倫理學審批函。

1.2 研究方法

1.2.1 分組 在適應環境后，將新西蘭大白兔隨機分為低濃度組（KGN濃度為1 μmol/L）、中濃度組（KGN濃度為5 μmol/L）、高濃度組（KGN濃度為10 μmol/L）及對照組（KGN濃度為0 μmol/L），每組各納入25例新西蘭大白兔。新西蘭大白兔均取仰臥位，采用膝關節腔穿刺法收集兔關節液。從外側關節間隙向兔膝關節腔內注射2 mL等滲鹽水，膝關節完全伸展并彎曲數次。然后，使用無菌注射注射器收集關節液和生理鹽水溶液。各組的飼養時間設定為1周。

1.2.2 細胞分離培養 采用特異性MSC培養基黏附培養法分離培養原代兔SF-MSCs。吸入后4 h內，用磷酸鹽緩沖鹽水稀釋滑膜液，通過40 mm尼龍過濾器（康寧公司，型號：SPINX）過濾并去除碎片，在100 mm的培養皿中電鍍，并在含10%胎牛血清（Gibco公司，批號2022-0111AS）和1%青霉素-鏈霉素（HyClone公司，批號2245HNBF）的基本DMEM的完全培養基中培養1周。將培養皿置于溫度為37 °C和濕度為5%RH CO2的細胞培養箱中進行培養，待培養時間達到48 h后，觀察并去除一直沒有貼壁的細胞，同時配置并更換培養基。

1.2.3 兔SF-MSCs的體外成軟骨誘導 將1×105兔SF-MSCs接種于玻璃底細胞培養皿24 h后，培養基改為無血清軟骨培養基（上海碧云天公司，批號2021-1215-10S），包括DMEM、1%胰島素-轉鐵蛋白-硒酸預混劑、100 nmol/L地塞米松、50 mmol/L l-抗壞血酸-2-磷酸、1 mmol/L丙酮酸鈉和0.35 mmol/L l-脯氨酸。然后，根據分組分別用不同濃度的KGN處理細胞21 d。

1.2.4 Ⅱ型膠原蛋白HE+膠原蛋白特染 ①常規蘇木-精伊紅染色法（HE）染色。②全自動特殊染色法染PAS和六胺銀，均采用全自動特殊染色儀（Ventana公司，型號：NexEs），使用的PAS和六胺銀染色試劑盒購自羅氏診斷公司（批號：BNU256），PAS時長39 min，六胺銀時長120 min，兩種染色可同時進行。

1.2.5 成軟骨分化標志基因表達研究 誘導后的各組兔SF-MSCs用TRIzol Reagent裂解，按照說明提取總RNA。每個樣品的總RNA采用RT-PCR逆轉錄為cDNA，采用實時PCR檢測COL2A1、SOX9、聚集蛋白聚糖（aggrecanaggrecan，ACAN）的mRNA表達水平。在該研究中，對照組采用GAPDH，每個樣品均完成3次重復實驗，取平均值，最終所得數據用CT法（2-ΔΔCT法）分析。

注：COL2A1的引物序列為5’-GCATCT CCTCCCTTGCTG-3’，5’-GGCTGGGAAGAGGGACAC-3’；SOX9的引物序列為5’- GCGAGCAGCAGCAGCACTC-3’，5’- TCTGG"TGGTCGGTGTAGTCATACTG-3’；ACAN的引物序列為5’- ACTCTGGGTTTTCGTGACTCT-3’，5’- ACACTCA GCG AGTTGTCATGG-3’。

1.2.6 蘇木精-伊紅染色法分析成軟骨細胞數量 將納入研究的標本在濃度為10%的中性甲醛溶液中，然后在濃度為10%的乙二胺四乙酸（EDTA）緩沖鹽水溶液中對標本做脫鈣處理，時間為28 d。石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，用HE染色，切片于200倍下取5個視野，并計算各組軟骨形態的細胞數量后取均值。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用F檢驗，Plt;0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ⅱ型膠原蛋白染色各組陽性面積占比比較 中濃度組Ⅱ型膠原蛋白染色陽性面積占比均顯著高于低濃度組、高濃度組和對照組，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見圖1、表1。

2.2 各組成軟骨分化標志基因的表達水平比較 中濃度組COL2A1、SOX9和ACAN的表達水平均顯著高于低濃度組、高濃度組和對照組，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表2。

2.3 各組成軟骨細胞數量比較 中濃度組成軟骨細胞數量均顯著高于低濃度組、高濃度組和對照組，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見圖2、表3。

3 討論

軟骨缺損是導致成年人殘障的主要原因，因此，需要新的策略來誘導軟骨細胞分化，促進軟骨的再生[5]。KGN是一種雜環結構的小分子化合物，可促進間充質干細胞向軟骨細胞分化，保護軟骨細胞不發生骨化。自被發現以來，KGN在組織工程和再生醫學中的應用得到了廣泛的擴展，包括肌肉骨骼、半月板和關節軟骨的再生策略。然而，單用KGN誘導軟骨形成的效果并不理想，阻礙了其進一步在臨床應用。然而，人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）經過KGN預處理后，可以有效地分化為軟骨細胞，但KGN預處理誘導的促軟骨和抗骨化作用的分子機制尚無定論。

本研究顯示中濃度組Ⅱ型膠原蛋白染色陽性面積占比、COL2A1、SOX9和ACAN的表達水平及成軟骨細胞數量均顯著高于低濃度組、高濃度組和對照組（Plt;0.05），這表明KGN添加劑可影響兔關節液來源的間充質干細胞向軟骨細胞的分化。針對KGN促進軟骨再生的作用機制，有學者研究發現[6-7]，在軟骨分化的情況下，KGN被證明可以抑制TGF-β3誘導的肥大，而TGF-β3被證明可以增加KGN的分化能力；對于體內軟骨再生，KGN的添加能夠抵消TGF-β3誘導的纖維軟骨的形成，TGF-β3能增強KGN的再生能力。

間充質干細胞是再生醫學中細胞治療的重要來源。在動物模型和人體臨床試驗中，間充質干細胞在修復各種退行性疾病中受損組織方面都顯示出了良好的效果；間充質干細胞具有歸巢能力，可以遷移到損傷部位，并具有分化為損傷部位局部成分的能力，以及分泌有助于組織再生的趨化因子和生長因子等細胞因子的能力。間充質干細胞可從眾多組織中分離出來，在所有間充質干細胞中，關節液來源的間充質干細胞的優勢在于其可以在治療過程中從關節損傷患者中輕松、無創地獲得[8-10]。此外，關節疾病患者關節液中間充質干細胞的數量顯著增加，這也就使得自體間充質干細胞植入成為可能[11-13]。此外，許多研究報道了KGN調節Ⅱ型膠原蛋白形成的作用機制[14-15]。SMAD3對軟骨形成的主轉錄因子SOX9的激活很重要，在TGF-β刺激的骨髓間充質干細胞中沉默SMAD2/3的表達可抑制軟骨分化[16-17]。本研究發現在骨髓間充質干細胞中加入KGN可提高COL2A1、SOX9和ACAN的表達水平。此外，最近的一項研究表明，TGF-β誘導的人骨髓間充質干細胞軟骨分化可能需要SMAD2/3和SMAD1/5/9通路，因此KGN可通過SMAD2/3通路協同促進軟骨分化[18-19]。

綜上所述，KGN能誘導關節液來源間充質干細胞向軟骨細胞分化，其中濃度為5 μmol/L的作用最明顯。

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