寒地水稻芽期耐冷性鑒定及轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展

摘" 要：在中國(guó)，水稻是全國(guó)第一大經(jīng)濟(jì)作物，由于我國(guó)60%以上的居民均以稻米為主食，因此水稻在我國(guó)糧食作物的生產(chǎn)規(guī)模上也具有重要作用。全世界每年有1 500萬(wàn)hm2左右的水稻受低溫威脅，然而水稻的芽期生長(zhǎng)狀況影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育，所以了解寒地水稻芽期的耐冷性特征，進(jìn)行水稻芽期耐冷性鑒定，是耐冷品種選育過(guò)程中親本選擇的首要任務(wù)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析探明水稻芽期耐冷的分子機(jī)制，根據(jù)其單核苷酸多態(tài)性特征開(kāi)發(fā)水稻耐冷相關(guān)功能性SNP標(biāo)記，將其應(yīng)用于水稻芽期耐冷品種選育的分子輔助育種中，是高效選育耐冷品種的重要手段和途徑。

關(guān)鍵詞：冷害；芽期；鑒定；轉(zhuǎn)錄組；SNP分子標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào)：S511" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號(hào)：2096-9902（2023）20-0010-04

Abstract： In China， rice is the largest economic crop in the country. Because more than 60% of the residents in China take rice as the staple food， rice also plays an important role in the production scale of food crops in our country. About 15 million square hectares of rice are threatened by low temperature every year in the world， but the growth status of rice at bud stage affects the growth and development of rice， so understanding the characteristics of cold tolerance of rice at bud stage and identifying cold tolerance at bud stage is the primary task of parent selection in the process of cold tolerant variety breeding. The molecular mechanism of cold tolerance in rice at bud stage was identified by transcriptome analysis， and a functional SNP marker related to cold tolerance was developed according to its single nucleotide polymorphism， and applied to the molecular-assisted breeding of cold-tolerant varieties at bud stage， which is an important means and way for efficient breeding of cold-tolerant varieties.

Keywords： chilling injury; budding stage; identification; transcriptome; SNP molecular marker

水稻的產(chǎn)量約占我國(guó)糧食總產(chǎn)量的一半，因此也被認(rèn)為是我國(guó)最主要的糧食作物之一。寒地水稻具有的優(yōu)質(zhì)特性廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。在寒地水稻生產(chǎn)過(guò)程中，冷害是寒地水稻在生產(chǎn)中重要的危害之一。在水稻的生長(zhǎng)過(guò)程中，水稻的芽期生長(zhǎng)發(fā)育狀況也會(huì)對(duì)水稻的生長(zhǎng)情況產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而影響后期水稻的產(chǎn)量，所以開(kāi)展對(duì)水稻芽期耐冷性的研究，對(duì)于篩選和培育出耐冷性較強(qiáng)的水稻種類(lèi)有著很重要的經(jīng)濟(jì)意義。

傳統(tǒng)的耐冷性水稻品種選育有育種效率低、育種年限長(zhǎng)的缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用分子輔助方法可以提高育種品質(zhì)，縮短了育種年限，但同時(shí)也需要深入研究和掌握更為緊密連鎖標(biāo)記。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-sequencing）的發(fā)展極為迅速，該方法既揭示特定的分子機(jī)制和生理過(guò)程，也是一個(gè)深度發(fā)現(xiàn)并分析與相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)基因的一項(xiàng)有效檢測(cè)方法，可準(zhǔn)確掌握關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)程度。對(duì)水稻芽期耐冷進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，探明其分子機(jī)理，根據(jù)其多態(tài)性開(kāi)發(fā)與水稻芽期耐冷性相關(guān)的SNP特異性引物，將其運(yùn)用于水稻芽期耐冷的分子輔助育種中，可有利于耐冷品種的選育。

1" 水稻芽期耐冷性資源鑒定

1.1" 水稻冷害

1.1.1" 水稻冷害概況

水稻冷害是指水稻生育臨界溫度遇到10℃以上[1]低溫影響，致使作物減產(chǎn)。

低溫冷害對(duì)作物生長(zhǎng)與發(fā)育的影響是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，因此低溫冷害不但受作物自身的遺傳基因制約，同時(shí)還會(huì)受到環(huán)境影響[2]。水稻從播種萌發(fā)到成熟期的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，都可能會(huì)遭遇到低溫冷害[3]。

1.1.2" 水稻芽期冷害

通過(guò)觀察低溫對(duì)水稻的影響，發(fā)現(xiàn)其會(huì)在4個(gè)階段造成損傷：芽期、苗期、孕穗期和開(kāi)花期[4]。

水稻的芽期低溫冷害是一種嚴(yán)重的氣候?yàn)?zāi)害，會(huì)導(dǎo)致水稻的幼苗在播種后的第一片葉子上出現(xiàn)嚴(yán)重的寒冷，甚至?xí)?dǎo)致植株的死亡和腐爛[5]。水稻的芽期冷害通常會(huì)被分為發(fā)芽期冷害和芽期冷害，水稻發(fā)芽期的耐冷性鑒定標(biāo)準(zhǔn)一般是水稻種子在低溫條件下發(fā)芽的能力，水稻芽期的耐冷性鑒定的標(biāo)準(zhǔn)一般為水稻種子萌發(fā)后在低溫條件下生長(zhǎng)發(fā)育成綠色幼苗的能力。水稻的芽期是水稻生長(zhǎng)發(fā)育的初期，是水稻產(chǎn)量的基期，所以篩選芽期耐冷的水稻品種對(duì)于培育耐冷的水稻品種具有重要的意義。

1.2" 水稻芽期耐冷性鑒定

1.2.1" 水稻發(fā)芽期耐冷性鑒定

水稻是否能進(jìn)入生活史的第一步是水稻是否能萌發(fā)，溫度變化對(duì)水稻發(fā)育的影響是非常顯著的[6]，所以針對(duì)水稻發(fā)芽期的耐冷性鑒定就變得尤為重要。水稻發(fā)芽期耐冷性又稱(chēng)為低溫發(fā)芽能力，從播種到發(fā)芽過(guò)程中受到的冷害。張坤等[7]認(rèn)為水稻芽期耐冷性的鑒定指標(biāo)是第一葉長(zhǎng)。姚曉云等[8]以發(fā)芽率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究得出日最低溫度和平均氣溫分別在10℃和15℃左右時(shí)，形成了較嚴(yán)重的發(fā)芽期低溫冷害，觀察雙親發(fā)芽率均存在極顯著差異[9]。

1.2.2" 水稻芽期耐冷性鑒定

水稻芽期耐冷鑒定常用的指標(biāo)為成苗率，鑒定方法參考韓龍植等[10]的方法，耐冷性評(píng)價(jià)為一級(jí)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)為所有幼苗全部誘發(fā)成綠苗。肖宇龍等[11]發(fā)現(xiàn)盡管有1～2個(gè)重復(fù)的成苗率達(dá)到100%， 其余也接近100%， 并且3個(gè)重復(fù)間出苗率并沒(méi)有顯著差異，所以將耐冷性極強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)改為90%以上幼苗全部誘發(fā)成綠苗，改良后的方法可以減小實(shí)驗(yàn)誤差。唐雙勤等[12]在江西地區(qū)進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，研究了33份早秈雜交稻品種和8份常規(guī)稻，并將死苗率作為主要的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，探索出適宜早秈稻芽期耐冷性的主要鑒定方法。此外，還將材料放置在8℃的低溫環(huán)境中，持續(xù)處理10 d，并根據(jù)恢復(fù)生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明，這些指標(biāo)都可以顯著提升芽期耐冷性的鑒定精度。張艷梅等[13]通過(guò)對(duì)140份東北地區(qū)主栽粳稻品種的死苗率進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其芽期耐冷性存在顯著的差異，死苗率的變化范圍在2%～98%，而且變異系數(shù)高達(dá)78.83%。

2" 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展

2.1" 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理

RNA-sequencing測(cè)序（RNA-seq）是一種研究方法，可以檢測(cè)特定時(shí)期細(xì)胞內(nèi)所有RNA的序列，其中包括mRNA序列[14]。

目前，RNA-seq技術(shù)可以對(duì)生物體整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行直接分析，也能夠?qū)ξ粗幕蝮w序列進(jìn)行分析，該技術(shù)也成為了一種強(qiáng)大的工具而被植物科研界廣泛應(yīng)用，被用來(lái)研究植物耐冷性品種以及生物個(gè)體和病原體之間相互作用的分子差異。通過(guò)使用軟件，我們可以對(duì)檢測(cè)到的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接處理，從而篩選出可靠的堿基序列，并進(jìn)行基因表達(dá)、功能解析、序列結(jié)構(gòu)分析以及其他信息學(xué)分析。基因研究包括統(tǒng)計(jì)表達(dá)、比較表達(dá)差異和聚類(lèi)分析。通過(guò)GO、KEGG、COG等技術(shù)，功能注釋可以更好地探索基因的功能，而序列結(jié)構(gòu)分析則可以更加精確地檢測(cè)mRNA的可變剪切、基因融合以及對(duì)基因結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。此外，生物信息學(xué)分析也可以更加準(zhǔn)確地揭示基因的功能，并且可以更好地理解基因體所組成的生物學(xué)信號(hào)通路的活動(dòng)[15]。

2.2" 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在水稻研究中的運(yùn)用

RNA-seq技術(shù)可以用來(lái)檢測(cè)特定生物學(xué)條件下的細(xì)胞或植物組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物組成，不僅可以幫助我們更好地理解生物學(xué)中的重要功能基因組結(jié)構(gòu)，而且還可以用來(lái)比較不同生物基因組之間的表達(dá)差異。其強(qiáng)大功能使得能夠檢測(cè)到任何生物的所有基因組表達(dá)，從而提供更精確的分子信號(hào)，更高效的檢測(cè)能力，并且檢測(cè)范圍更加廣泛。隨著生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展，包括高通量RNA檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展，使RNA-seq成為基因組表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組分析新的重要手段[16]。

基因組檢測(cè)是一種新興的方法，可以幫助我們更好地了解水稻對(duì)冷的響應(yīng)。例如，Byun等[17]科學(xué)家使用了表達(dá)DaCBF7基因的水稻作為樣本，并使用這種方法成功地從2種水稻樣本中提取了9個(gè)和15個(gè)冷響應(yīng)基因。此外，Sperotto等[18]還使用了秈稻作為樣本，并使用了這種方法來(lái)探索水稻對(duì)冷的響應(yīng)的機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，耐冷材料的基因表達(dá)非常豐富，特別是那些與纖維合成、脂代謝相關(guān)的基因。此外，這種材料還擁有較強(qiáng)的鈣離子信號(hào)傳輸、光合作用以及抗氧化性。Shen等[19]通過(guò)3種不同的基因類(lèi)型以及1種冷敏基因的轉(zhuǎn)錄組分析，研究了材料的冷脅迫特性。研究結(jié)果顯示，總計(jì)2 242個(gè)基因類(lèi)別，其中318個(gè)基因類(lèi)別與冷脅迫相關(guān)。通過(guò)GO富集分析還發(fā)現(xiàn)，鈣離子的信號(hào)傳輸是影響水稻耐冷性的關(guān)鍵因素。研究表明，RNA解旋酶具有重要的作用，不僅有助于提高水稻的抗寒性，而且具有潛在的功效。利用RNA-seq完成水稻耐冷性基因和不耐冷性基因的鑒定工作，并對(duì)篩選出來(lái)的耐冷性基因進(jìn)行SNP分子標(biāo)記。

3" 水稻SNP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

3.1" 水稻SNP分子標(biāo)記的特點(diǎn)

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，可以通過(guò)染色體單個(gè)核苷酸的變異來(lái)表征，這種現(xiàn)象可以通過(guò)多種植物分析軟件，如Polybayes和SNP pipeline來(lái)檢測(cè)。然而，當(dāng)沒(méi)有進(jìn)行基因體測(cè)序的動(dòng)植物種類(lèi)或測(cè)序品種數(shù)量較少時(shí)，通常可以使用電子SNP技術(shù)來(lái)進(jìn)行測(cè)序[20]。

3.2" SNP分子標(biāo)記在水稻中的應(yīng)用

目前已經(jīng)研究出多種DNA分子標(biāo)記法，SSR標(biāo)記更具有優(yōu)勢(shì)。不過(guò)基于趨同性，進(jìn)行相關(guān)的關(guān)聯(lián)分析時(shí)不適用SSRs。SNP不僅不需要精確的DNA片段尺寸，還可以利用先進(jìn)的自動(dòng)化微陣列技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的單拷貝區(qū)定位，這使得其優(yōu)勢(shì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)SSR。此外，由于使用雙等位標(biāo)記，其雜交率也會(huì)顯著降低[21]。

經(jīng)分析，秈-粳雜交群體的SNPs分布表明，其中26.6%的SNPs可見(jiàn)，這意味著，當(dāng)使用2個(gè)標(biāo)記來(lái)分析1個(gè)關(guān)鍵的基因的QTL標(biāo)記時(shí)，僅僅使用8個(gè)SNP，便可完成整個(gè)群體的分子分析，這一方法的效率比目前普遍采用的SSR標(biāo)記更加優(yōu)越[22]。SNP作為一種基因表征技術(shù)，不僅能夠被應(yīng)用于分子標(biāo)記，還能夠被用來(lái)構(gòu)建基因表征的遺傳圖譜，從而更好地識(shí)別出單核苷酸多肽的基因表征。鄭向華等[23]的研究表明，4k-SNP和40-SNP能夠有效地檢測(cè)出49份品種的粳型指數(shù)，其相關(guān)系數(shù)甚至超過(guò)了0.98 ，而且，當(dāng)這2種指數(shù)相關(guān)時(shí)，之間的正相關(guān)關(guān)系非常明確，P≤0.001，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.86。經(jīng)過(guò)SNP技術(shù)的應(yīng)用，秈粳的基因型和表型數(shù)據(jù)的結(jié)果十分一致，這也證實(shí)了該技術(shù)的可靠性。因此，使用SNP技術(shù)來(lái)篩選水稻的耐寒性基因，將會(huì)帶來(lái)巨大的好處。

3.3" SNP標(biāo)記在水稻芽期耐冷中的應(yīng)用

唐江紅[5]在水稻芽期耐冷性的研究中，以吉冷1號(hào)粳稻和密陽(yáng)23號(hào)秈稻為親本自交，在F10代中檢測(cè)到了3個(gè)QTL，并利用ICIMapping4.0構(gòu)建出了118個(gè)SNP標(biāo)記和177個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，并分析出在低溫環(huán)境和正常環(huán)境下所有性狀出現(xiàn)不同程度的雙向超親分離。宋佳[3]對(duì)295份粳稻品種的萌發(fā)期進(jìn)行了耐冷性的鑒定研究，對(duì)396個(gè)高質(zhì)量SNP進(jìn)行GWAS分析，培育適宜低溫地區(qū)直播水稻新品種，對(duì)選擇和利用分子育種改進(jìn)粳稻萌發(fā)期耐冷性提供理論依據(jù)。在劉友發(fā)[24]的研究中，使用Y58S與2號(hào)雜交，創(chuàng)造出“Y兩優(yōu)2號(hào)”的高級(jí)重組自交系，并使F14作為模型，SNP作為分子標(biāo)記，從而創(chuàng)造出一個(gè)具有較強(qiáng)抗寒性的遺傳圖譜，從而可以更準(zhǔn)確地識(shí)別出與抗寒性相關(guān)的QTL或基因，從而大大增強(qiáng)了該品種的抗寒性。張斌[25]通過(guò)對(duì)550份種質(zhì)資源的分析，發(fā)現(xiàn)20 000個(gè)SNPs標(biāo)記，這些分析成果可以應(yīng)用于群體的遺傳學(xué)研究以及基因組關(guān)聯(lián)分析，并且通過(guò)連續(xù)的回交，大大增強(qiáng)了秈稻不育系的苗期抗寒能力，從而大幅度地提升了雜交稻的抗寒能力。

4" 結(jié)論

就目前來(lái)看，RNA-seq已經(jīng)大量用于水稻的研究中。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)結(jié)合水稻低溫脅迫下耐冷性品種（系）的轉(zhuǎn)錄組差異進(jìn)行分析，尋找關(guān)鍵候選基因相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑，進(jìn)而對(duì)水稻芽期耐冷性差異基因篩選和富集分析，明確水稻芽期耐冷的分子機(jī)制，挖掘與水稻耐冷相關(guān)的基因，并進(jìn)行SNP功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)，利用引起變異的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)功能標(biāo)記，在分子輔助育種中可以提高育種效率，加速育種技術(shù)的革新，培育出耐冷性的水稻品種，進(jìn)而節(jié)省水稻的育種成本。

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